WWOX 基因转染对卵巢癌干细胞增殖的抑制作用及其机制探讨-论文.pdf

《WWOX 基因转染对卵巢癌干细胞增殖的抑制作用及其机制探讨-论文.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、山东医药2014年第54卷第l4期WWOX基因转染对卵巢癌干细胞增殖的抑制作用及其机制探讨仝建业。闫洪超(1徐州医学院研究生院，江苏徐州221002；2徐州医学院附属医院)摘要：目的探讨外源性WWOX基因转染对人卵巢癌干细胞增殖的抑制作用及机制。方法用脂质体介导的方法将pcDNA3．1-WWOX真核表达载体转染人卵巢癌干细胞，分为pcDNA3．1-WWOX重组质粒组、空质粒组及未转染组。应用G418筛选阳性细胞克隆并扩增，Westernblot法检测各组细胞WWOX蛋白的表达，流式细胞仪分析细胞DNA周期变化，Westernblot方法检测各组细胞Cyclin

2、D1、CDK4蛋白的表达。结果重组质粒组WWOX蛋白高表达，空质粒组及未转染组细胞未检测到WWOX蛋白的表达。重组质粒组细胞的G。／G。期细胞比例高于空质粒组及未转染组(P<0．01)，S期比例低于空质粒组及未转染组(P<0．01)。重组质粒组CyclinD1、CDK4表达均低于空质粒组及未转染组(P<0．05)。结论WWOX基因转染可能通过下调CyclinD1、CDK4的表达而抑制人卵巢癌干细胞增殖，可能为卵巢癌的生物治疗开辟新的思路。关键词：卵巢癌；WWOX基因；转染；细胞周期；细胞增殖’doi：10．3969／j．issn．1002-266X．2014．

3、14．023中图分类号：R737．31文献标志码：B文章编号：1002-266X(2014)14-0058-03WWOX基因是一种抑癌基因⋯。研究证实，饱和湿度培养箱中培养，0．25％胰蛋白酶消化传代。WWOX基因突变或缺失与胰腺癌、乳腺癌、肺癌等1．2．2基因转染按Lipofectamine2000说明书恶性肿瘤的发生发展及预后密切相关，通过改变将pcDNA3．1一WWOX及pcDNA3．1空质粒分别转WWOX基因的表达可以调节肿瘤生长_2“J。Cyclin染对数生长期的卵巢癌干细胞，以600~g／mL新霉Dl基因是细胞增殖调控的关键蛋白，是一种癌基素衍生物

4、G418维持筛选，挑选阳性细胞克隆，扩增因。在G期，当CyclinD1与细胞周期素依赖性激培养。分别将成功转染pcDNA3．1-WWOX和pcD．酶(CDK4)结合后，可以激活后者的磷酸酶活性，使NA3．1质粒的干细胞组命名为pcDNA3．1-WWOX肿瘤抑制蛋白Rb发生磷酸化，促进肿瘤发生。我重组质粒组、空质粒组，以未转染的卵巢癌干细胞作们将外源性WWOX基因转染到人卵巢癌干细胞中，为未转染组。研究其对CyclinD1、CDK4蛋白的影响，探讨治疗卵1．3检测指标巢癌的新方法。1．3．1WWOX蛋白表达采用Westernblot法。常1材料与方法规提取pcD

5、NA3．1一WWOX重组质粒组、空质粒组及1．1材料卵巢癌干细胞由本课题组筛选并保对照组细胞总蛋白，参照BCA法说明书测定蛋白浓存j，pcDNA3．1．WWOX真核表达载体由本课题组度。以10％凝胶进行SDS．聚丙烯酰胺凝胶泳(SDS—构建并保存6]，pcDNA3．1空质粒由徐州医学院分PAGE)、转膜、WWOX单克隆抗体结合，再用碱性磷子生物学研究中心胡书群老师惠赠，脂质体Lipo—酸酶结合的二抗结合，增强化学发光法(ECL)显色后fectamineM2000转染试剂盒、G418购自Invitrogen照相，观察各组细胞WWOX蛋白表达情况。公司，WWOX、

6、CyclinD1和CDK4一抗及二抗均由1．3．2细胞周期分布采用流式细胞仪分析。将Chemicon公司提供，碘化丙啶(PI)细胞周期检测试对数生长期的三组细胞分别用0．25％胰蛋白酶消剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。化，按3X10／孔细胞在6孔板上接种细胞，分别在1．2实验方法细胞接种后48h收集上述各组细胞，各约1X10。1．2．1细胞培养人卵巢癌干细胞培养于含10％个细胞，加入终浓度70％冷乙醇，4cc固定24h，胎牛血清的RPMI1640完全培养基，37、5％CO2PBS洗涤离心三遍，加入RnaseA(1mg／mL)于37℃水浴30rain，再加

7、25mg／mL的PI染色，4℃避光通信作者：闫洪超30min，经尼龙网过滤后，流式细胞仪检测各组细胞58山东医药2014年第54卷第14期周期分布情况，计算各组G。／G期、s期、G／M期细碱基。WWOX基因在多种恶性肿瘤组织中表达异胞所占百分数。常，可能是一个广谱的抑癌基因。研究表明WWOX1．3．3CyclinD1及CDK4蛋白表达采用Western基因在恶性肿瘤尤其是性激素依赖性肿瘤的发生发blot法。常规提取pcDNA3．1一WWOX重组质粒组、展中起着重要作用-9]。Gourley等叫研究发现卵空质粒组及对照组细胞总蛋白，参照BCA法说明书巢癌组织中W

8、WOXmRNA的表达降低，提示i贝0定