亚洲玉米螟酚氧化酶原的原核表达和性质分析-论文.pdf

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1、昆虫学报ActaEntomologicaSinica，July2014，57(7)：798—805ISSN0454-6296亚洲玉米螟酚氧化酶原的原核表达和性质分析赵同伟撑，张兵#，吕文静。，翟会锋。，吴桃燕，张石洋，汤小伟，冯从经(1．扬州大学园艺与植物保护学院植物保护系，江苏扬州225009；2．江苏省大丰市农业干部学校，江苏盐城224100；3．江苏省泰州市出入境检验检疫局，江苏泰州225300)摘要：【目的】昆虫体内酚氧化酶原(PPO)是一种重要的天然免疫蛋白，参与昆虫的体液免疫和细胞免疫过程。本研究采用原核表达体系，大量表达可溶且具有活

2、性的重组PPO蛋白，可用于各种酚氧化酶(PO)抑制剂的筛选，从而为创制抑制昆虫免疫系统的新型杀虫剂提供条件。【方法】利用从亚洲玉米螟Ostriniafurnacalis5龄幼虫体内克隆获得PPO基因，构建了pET一28b．PPO原核表达载体，在大肠杆菌Escherichiacoli中重组表达了亚洲玉米螟PPO蛋白；采用Ni—NAT亲和层析柱快速纯化目的蛋白，进行了Western杂交鉴定；测定分析了重组PPO蛋白激活为PO后的酶学性质以及不同金属离子(Mg“，cu和Fe)对PPO二级结构的影响。【结果】融合蛋白PPO得到了表达和纯化。重组PPO蛋白

3、激活为PO后最适反应温度为3O℃，最适pH为7．2，以L—DOPA为底物时PO催化反应的为140．8U／mg·min，Km为2．96mmol／L。Fe存在的情况下重组PPO蛋白中B一折叠结构成分显著增加至53．7％±4．6％，仅一螺旋结构成分则显著下降至2．6％4-1．2％(P<0．05)；有Mg存在的情况下，重组PPO蛋白中B-折叠结构成分显著下降，ot一螺旋结构成分稍有上升。有cu“存在的情况下，重组PPO蛋白中B一折叠结构成分显著下降为10．0％±1．6％，而ot．螺旋结构成分则上升至35．3％±6．9％。【结论】结果说明不同金属离子对重组

4、PPO蛋白的二级结构有显著影响。关键词：亚洲玉米螟；酚氧化酶原；原核表达；蛋白纯化；酚氧化酶；酶学性质中图分类号：Q966文献标识码：A文章编号：0454-6296(2014)07-0798-08Prokaryoticexpressionandcharacterization0fpr0phenOl0xidasefromtheAsiancornborer．Ostriniafurnacalis(Lepidoptera：Pyralidae)ZHAoTong—Wei，ZHANGBinglj，LOWen．Jing，ZHAIHui．Feng，WUTao—Ya

5、n，ZHANGShi—Yang。TANGXiao—Wei。FENGCong．Jing(1．DepartmentofPlantProtection，CollegeofHorticultureandPlantProtection，YangzhouUniversity，Yangzhou，Jiangsu225009，China；2．DafengSchoolofAgriculturalCadres，Yancheng，Jiangsu224100，China；3．TaizhouEntry—ExitInspectionandQuarantineBureau，Ta

6、izhou，Jiangsu225300，China)Abstract：【Aim】Prophenoloxidase(PP0)isanimportantimmuneproteinininsects，whichisinvolvedininsecthumoralimmunityandcellularimmunity．Inourstudy，theprokaryoticexpressionsystemwasappliedtoexpresssolublerecombinantPPOwithactivityonalargescale．Therecombinant

7、PPOwasusedtoscreenvariousphenoloxidase(PO)inhibitorssoastocreatenovelinsecticidestargetedontheinsectimmunesystem．【Methods】UsingthePPOgeneclonedfromthe5thinstarlarvaeoftheAsiancornborer，Ostriniafurnacalis(Guen6e)，theprokaryoticexpressionvector，pET-28b—PPO，wasconstructed，andthe

8、recombinantPPOproteinwasexpressedinEscherichiacoli．Thefusionproteinw