α-淀粉酶基因amyP的原核表达及酶学性质初步分析-论文.pdf

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1、第8期(总第362期)农产品加工(学刊)No．82014年8月AcademicPeriodicalofFarmProductsProcessingAug．文章编号：1671—9646(2014)08b一0033—020c一淀粉酶基因amyP的原核表达及酶学性质初步分析赵金海，杨灵，张志芳，李轶女(1．河南省轻工业学校轻工工程系，河南郑州450000；2．中国农业科学院生物技术研究所，北京100081)摘要：一淀粉酶作为一种十分重要的酶制剂，目前工业上都是以微生物发酵法大规模生产的。从耐高温菌株Geobacillus．P

2、OT一5基因组中，用PCR的方法扩增得到该菌的仅一淀粉酶基因，此基因被克隆、测序，并在原核Escherichiacoli表达系统中进行表达，并对该重组酶的酶学性质进行初步的分析。关键词：Ot一淀粉酶；原核表达；酶学性质中图分类号：Q75文献标志码：Adoi：10．3969／jissn．1671—9646(X)．2014．08．044ProkaryoticExpressionandEnzymaticPropertiesAnalysisofOt—．AmylasesGeneamyPZHAOJm-hal，YANGLingI，Z

3、HANGZhi-fand，"LIYi-nC(1．LightIndustrialEngineeringDepartment，He‘nanLightIndustrySchool，Zhengzhou，He’nan450000，China；2．BiotechnologyResearchInstitute，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100081，China)Abstract：0【一amylaseisaveryimportantenzyme．themassproduct

4、ionof-amylaseisbasedonmicroorganismfermentationintheindustryatpresent．Thegeneof0【-amylases(amyP)isamplifiedfromthegenomeofthethermostablestrainGeobacillus．POT-5byPCR．Thisgeneiscloned，sequenceanalysisandexpressedinprocaryoticexpressionsysteminE．coli．Thisstudyalso

5、developsapreliminaryanalysisofenzymepropertiesabouttherecombinant0【-amylase．Keywords：Ot—amylase；procaryoticexpression；enzymaticcharacteristic一淀粉酶(EC3．2．1．1)是从淀粉糖链内部随1材料与方法机切断一1,4一葡萄糖苷键，生成糊精和还原糖的一种内切酶类。其广泛存在于动物、植物和微生物1．1材料与试剂中，能使黏稠的淀粉糊很快失去黏性而液化，碘的呈GeobacillusPOT一

6、5由本实验室筛选分离所得。色反应很快消失，故又称为淀粉液化酶【”。自1894年大肠杆菌DH10B，BL21，克隆载体pMD18一T，表开始工业生产淀粉酶以来，该酶已成为目前用途最达载体pET22b(+)，均由笔者所在实验室保存。高保广产量最大的酶制剂之一，占到了整个酶制剂市场真DNA聚合酶Platinumpfu，Invitrogen公司产品；份额的25％左右，大量应用于粮食加工、食品工业、各种限制性内切酶，T4DNA连接酶及配套缓冲液，酿造、发酵、纺织、医药等行业。淀粉酶的来源很Promega公司产品；生化试剂IPTG

7、，SDS及可溶性广泛，可以来自于植物、动物以及微生物。大部分的淀粉，Sigma公司产品；胰蛋白胨、酵母抽提物，淀粉酶存在于微生物，目前许多种来源于真核和原核OXOID公司产品；PCR寡核苷酸引物由nvitrogen生微生物的Ot一淀粉酶被分离，其基因已被克隆囝。物公司合成；其他均为分析纯试剂。本研究从嗜热菌Geobacillus．POT一5中克隆了1．2方法0【一淀粉酶(仅一amylases)基因，使其在大肠杆菌表1．2．1DNA操作技术达系统中得到了表达，并对该重组仅一淀粉酶的酶参照分子克隆实验指南[3]进行DNA基

8、本操作技学性质进行了初步的研究。术，如质粒的提取、感受态细胞的制备和转化等。收稿日期：2014—06—20基金项目：国家自然科学基金资助项目(31070139)。作者简介：赵金海(1962一)，男，本科，高级讲师，研究方向为食品生物技术。’通讯作者：李轶女(1972一)，女，博士，副研究员，研究方向为病毒分子生物学。农产品加工(学