基因工程的基本技术

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1、第二章 基因工程操作的基本技术主要内容核酸提取技术凝胶电泳技术PCR技术DNA重组技术核酸杂交技术基因文库构建基因工程技术重组子克隆基因工程的基本技术之一第一节一、核酸提取技术核酸包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）;脱氧核糖核酸（DNA）包括线状基因组DNA和环状DNA（质粒DNA）。1、植物组织中基因组DNA的提取思考：DNA如何从细胞中取出？ⅰ植物组织中基因组DNA的提取原理：用机械研磨使组织和细胞破碎，然后加入SDS、CTAB等离子型表面活性剂，使细胞膜和核膜破裂，解聚核中的核蛋白（并与蛋白质形成混合物），

2、然后在酚和氯仿等表面活性剂的作用下使蛋白变性，再经离心除去组织和变性蛋白，上清夜加乙醇使DNA沉淀。再思考：1、研磨破碎组织必须在低温下进行。------为什么？2、幼嫩组织DNA的得率高还是低？防止DNA降解。得率高！ⅱ提取DNA的质量鉴定：DNA的相对完整性：凝胶电泳DNA的纯度：测OD值吸收峰：DNA紫外光260nm蛋白质紫外光280nm比值：OD260/280=1.8-2.0较纯OD260/280<1.8-2.0杂质多2、质粒DNA的提取基因组DNA质粒DNA质粒具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传

3、信息。质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。ⅰ质粒DNA提取方法：碱裂解法、煮沸法、SDS法等ⅱ碱裂解法原理：在碱性条件下，双连DNA氢键断裂，结构破坏变性，环状超螺旋质粒不充分变性。在中性条件下变性质粒恢复原来构型，而线性大分子细菌DNA不能复性呈不溶物而经离心除去。抽提质粒DNA所需的溶液：§、溶液Ⅰ：50mol/L葡萄糖，25mmol/LTris-Cl（pH8.0），10mmol/LEDTA(pH8.0)；§、溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH

4、，1%SDS(w/v)，现配现用；§、溶液Ⅲ：3mol/LKAc，用冰醋酸调pH值至5.2；实验步骤1、接种、摇菌；2、把菌液放入Ep管中，离心，弃上清；3、加入200μL预冷的含Rnase的溶液I，涡旋混匀；4、加入200μL的溶液Ⅱ，温和混匀，室温静置5min；5、加入200μL的溶液Ⅲ，温和混匀，冰浴15min；6、离心，吸上清至另一EP管；7、加等量的氯仿/异戊醇（V：V=24：1）抽提，离心；8、移取上清液，加入2倍体积无水乙醇，混匀，-20℃静置5min，离心，弃上清；9、用70%乙醇洗DNA沉淀2次，离心，倒掉乙醇，吹干；10、用T

5、E（pH8.0，）溶解质粒DNA，并加入RnaseA达浓度为10μg/ml，37℃放置1小时11、取1μL质粒DNA用于电泳检测。ⅲ抽提出质粒的构型：1）超螺旋质粒DNA:在提取质粒过程中，超螺旋DNA占大部分。2）开环质粒DNA：如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成松驰型的环状分子，称开环DNA。3）线状质粒DNA：如果质粒DNA的两条链在同一处断裂，则形成线状DNA。抽提出的质粒三种构型电泳结果：1）开环2）线状3）超螺旋+-电泳方向DNA的浓缩与纯化（P31-33）♪DNA的浓缩：＠乙醇沉淀法＠

6、正丁醇抽提法＠聚已二醇浓缩法♫DNA的纯化：＠氯化铯－溴化已锭连续梯度离心法＠离子交换层析法＠琼脂糖凝胶电泳洗脱法＠“基因纯”试剂纯化二、凝胶电泳技术电泳目的：对核酸分子进行分离和检测琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳核酸分子分离的原因：在碱性环境下，核酸分子带负电荷，在外加电场的作用下，分子在凝胶多孔性刚性滤孔中从负极向正极泳动，其中主要由于分子筛效应和电荷效应达到分离不同大小核酸分子的目的。电泳类型：（一）、影响电泳迁移率的因素1、分子本身的影响分子的大小：小则快带电荷数：多则快分子构型：超螺旋>解螺旋2、电场：直流电场电压高则快电压

7、太高则结果不准确常用3~5V/CM操作简单；分辨范围：100bp-60kb；有效范围：200bp-50kb；分辨率：100bp左右3、支持物介质低熔点琼脂糖：用于DNA的回收（65℃）A种类：琼脂糖（agarose）凝胶：常用于微卫星、测序分析；分辨范围：5-500bp；分辨率：1bp聚丙烯酰胺凝胶：注意：有神经毒性！！♦凝胶分辨DNA的能力：琼脂糖聚丙烯酰胺凝胶浓度分辨范围(kb)浓度分辨范围(bp)0.3%5-603.51000-20000.6%1-20590-5000.7%0.8-108.060-4000.9%0.5-71

8、240-2001.2%0.4-61525-1601.5%0.2-3206-100B凝胶浓度:浓度大，筛孔小，适合小分子电泳；浓度小，