基因工程的基本过程

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1、基因工程的基本过程基因工程主要包括几个过程：1、目的基因的制备；2、选择合适的载体，将目的基因与载体相连接生成重组DNA分子；3、将重组DNA片段导入受体；4、选择目的基因；5、目的基因的表达。对于整个基因过程来讲，目的基因的获取是关键，它直接涉及到产物，而且还影响到产物的量。很多在基因操作过程中，目的基因是很难获得的，所以通常采取先生成基因文库的方法，然后从基因文库中筛选。如果目的基因的序列以及它的调控等信息很清楚，可以直接通过PCR或cDNA获取，这样就大大减少了选择目的基因的盲目性，可以将整个过程简化为以

2、下步骤：图10-3-8基因工程过程　(1)目的基因的分离和制备目的基因是指准备导入受体细胞内的，以研究或应用为目的所需要的外源基因称目的基因。获得目的基因的方法很多，但也是十分困难的一步。目前获得目的基因有4条途径：1.从生物基因组群体中分离目的基因   原核生物基因组较小，基因容易定位，用限制性内切酶将基因组切成若干段后，用带有标记的核酸探针，从中选出目的基因。真核生物一般通过基因组文库的方法获得目的基因。图10-3-1限制性内切酶限制性内切酶(restrictiveenzyme)是20世纪60年代末在细菌中

3、发现的，能水解DNA分子骨架的磷酸二酯键，使一个完整的DNA分子切成若干段，每一种限制酶，都有自己特定的作用位点，而且切口或切下来的序列，往往是回文结构（palindromes）。例如EcoRI把GAATTC在GA之间切开，形成粘性末端。也有一些限制酶作用的结果产生不含粘性末端的平整末端，如HapI。多在原核生物中存在，能识别4～6个特苷酸特定的碱基序列。限制酶对细菌有保护作用，某些入侵的噬菌体可因DNA链被限制性酶切断而不能在细菌中繁殖，“限制”因此而得名。限制酶不能切开细菌本身的DNA，这是因为细菌DNA的

4、腺嘌呤和胞嘧啶甲基化（-CH3）而受到保护之故。这样就可以用限制性内切酶把一个基因组DNA分成很多片段，对于原核生物比较小的基因组来说，可以直接用标记地探针来获取在通过特定的方法，对于比较大的基因组，可以先制作基因文库，然后钓取所需要的带有目的基因的片段。2.人工合成目的基因DNA片段   人工合成目的基因DNA片段有化学合成和酶促合成法两条途径。一般是采用DNA合成仪来合成长度不是很大的DNA片段。3.PCR反应合成DNA   聚合酶链式反应（PCR)是以DNA变性、复制的某些特性为原理设计的。通过PCR技术

5、获取所需要的特异DNA片段在实际应用用得非常多，但是前提条件是必须对目的基因有一定的了解，需要设计引物。PCR技术的原理如下：图10-3-2PCR原理图（1）以混合的DNA片段作模板，例如，可以用cDNA基因文库做模板，在90℃高温下，作为模板的双链DNA均变性，分开成为单链DNA。（2）在反应体系中以有两种合成的DNA小段寡聚核苷酸做引物，这两种寡核苷酸应可以分别和特异DNA片段的正链的3'末端与负链的3'末端相结合。寡核苷酸引物要在50℃的温度下，才能较好的找到可以配对的正链和负链，形成互补结合。显然，在混

6、合DNA片段作模板的情况下，只有可以形成配对关系的DNA链才可特异性地结合引物寡核苷酸。这个过程又称为淬火。（3）反应体系中还有高温DNA聚合酶，以及作为原材料的四种脱氧核苷三磷酸（4XdNTP)。高温DNA聚合酶来自一种特殊的耐高温细菌，俗称Taq酶。在70℃高温下，经Taq酶催化，以四种脱氧核苷三磷酸为原料，在形成互补的引物寡核苷酸后，迅速合成一条与模板DNA单链（正链或负链）互补结合的DNA新链。（4）以上三个步骤周而复始，即反应体系的温度从90oC-50oC-75oC，反应体系中经历：变性（DNA双链变

7、性生成单链）——淬火（寡核酸引物和特异的DNA模板结合，配对）——合成（以引物为起点，合成与模板互补的DNA新链）。每次循环约需6-10分钟。经过20次循环，能与引物特异结合的那段DNA——即需要放大增殖目的DNA分子，可以扩增106倍。4.mRNA差异显示法获得目的基因   mRNA差异显示(mRNAdifferentialdisplay,DD)是1992年由哈佛医学院PengLiang等人建立的。原理是先用PCR技术扩增所有的mRNA、生成cDNA群体，再用测序凝胶电泳获取所需要的目的基因，然后再次用PCR

8、扩增。简单的讲，就是从基因的转录产物mRNA来反转录成cDNA作为目的基因。5、用机械的方法，例如超声波把基因组打成片段。　(2)DNA片段和载体的连接外源基因（DNA片段）很难直接透过受体细胞的细胞膜进入受体细胞，即使进入，也会受到细胞内限制性酶的作用而分解。要将外源DNA片段导入受体细胞，必须选择适当的载体（Vector），这是关键步骤之一。载体是携带外源基因进入受体细胞的工具。作