基因工程的基本程序

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1、CloningVectors二、基因工程的基本程序载体质粒外源DNA片段外源DNA插入剪切引入宿主细胞选出含有重组DNA的细胞扩增表达abbAAb第三章      基因克隆载体第一节       质粒载体第二节       噬菌体载体第三节       真核细胞的克隆载体第一节       质粒载体一、质粒的基本特性二、质粒的分离纯化方法三、质粒载体的选择四、大肠杆菌质粒载体五、多种功能的衍生质粒的组建一、质粒的基本特性1．质粒及其命名2．质粒的种类3．质粒的复制类型4．质粒的分子生物学特征二、质粒的分离纯化方法1．氯化铯溴

2、乙锭浮密度超速离心密度梯度分离法（图3-3）2.Triton和PEG化学提取法3．煮沸裂解菌体，异丙醇沉淀质粒DNA4．碱变性法抽提质粒DNA质粒的存在形式：呈共价闭合环状①超螺旋的SC构型（cccDNA）②松弛开环的OC型（ocDNA）③松弛线性的L构型（cDNA）基本步骤：细菌生长和质粒的扩增菌体收获和溶菌质粒纯化氯化铯浮密度分离法当各种DNA分子在有饱和溴乙锭染料存在下进行氯化铯密度梯度离心时，与共价闭环状分子结合的染料要大大少于与开环状或线状DNA的结合，因此，在氯化铯梯度离心中质粒DNA与染料相结合后生成的条带是在

3、较高的密度范围内，而断裂为线状的染色体DNA与溴乙锭结合较多，生成的条带是低密度范围。所以，离心后形成2条带，上面的条带主要是染色体DNA及少量开环状质粒DNA，下面的带则是共价闭合环状质粒DNA。碱变性法抽提质粒DNA该法也是一种快速抽提质料DNA的方法。其分离原理，大肠杆菌的染色体约有4700KB长，在处理细胞过程中都断裂成不同长度的双链DNA片段。当溶液的PH调到大于12时双链DNA中的氢键被破坏，于是染色体DNA的双链便分离成单链，而超螺旋状态的质粒DNA仅仅是氢链被破坏，并只发生部分双链解离成单链的变化。再当PH调

4、回中性时单链DNA互相缠绕且与蛋白质结合生成网络状大分子，而超螺旋的质粒发生复性反应后仍是小分子，通过离心的方法很容易将二者分开，达到分离的目的。三、质粒载体的选择作为理想的质粒载体，应具备以下几个条件（1）能自主复制，即本身是复制子（2）具有一种或多种限制酶的单一切割位点，并在此位点中插入外源基因片段，不影响本身的复制功能；（3）在基因组中有1-2个筛选标记，为寄主细胞提供易于检测的表型特征，（4）分子量要小，多拷贝，易于操作。四、大肠杆菌质粒载体1．pSC101质粒载体2．pBR322质粒载体分别由pMB1(ori)、p

5、SF2124(Ampr)和pSC101(Tetr)三种质粒通过载体改造后形成，使之具有松弛型ori和Ampr及Tetr两种抗性基因的理想的基因克隆载体。Ampr（Scal、PvuI、PstI切点）Tetr（EcoRI、Nhel、BamHI、SphI、HindIII切点）五、多种功能的衍生质粒的组建（一）、带有不同种类抗性基因的质粒载体（二）、高拷贝数质粒pAT153（三）、正选择质粒（四）、多功能质粒-PUC质粒带有不同种类抗性基因的质粒载体pBR328是从pBR322改建成的质粒，大小为4.907kb,它具有Ampr、Te

6、tr和Cmlr基因。Cmlr基因有EcoRI、PvuⅡ和BalI的单一酶切位点。除了pBR328外，pBR325也有类似结构。pAT153是由pBR322质粒改造而成，这种质粒的拷贝数比pBR322高1.5～3倍。它的大小是3.6kb,选择标记有氨苄青霉素抗性基因Ampr和四环素抗性基因Tetr、单一切点的限制性内切核酸酶有PvuⅠ、PstⅠ、BamHⅠ、ScaⅠ、SalⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ。正选择质粒pTR262是正选择质粒。在这种质粒中，在四环素的抗性基因（Tetr）前有λ噬菌体的PR启动子，同时在这种载体中还带有

7、λ噬菌体编码CI蛋白质（阻遏物）的基因。没有外源基因插入时，由于CI蛋白质阻遏从PR进行的转录作用，因此对四环素不表现抗性。在CI蛋白质基因上有单一的HindⅢ和BclⅠ切点，若利用其中任何一个切点插入外源DNA片段，都可以使CI蛋白质基因功能丧失，结果PR激活Tetr基因表达；表现出对四环素的抗性，达到正选择的效果。第二节噬菌体载体一、噬菌体的一般生物学特性二、λ噬菌体载体三、粘性质粒四、单链DNA噬菌体载体烈性噬菌体温和噬菌体溶源化细菌溶源化原噬菌体二、λ噬菌体载体（一）λDNA分子(1)λ噬菌体基因结构：如图3-11、

8、3-12Cos位点（Cohesive-endsite）：λDNA为线状双链分子，两端各有12个碱基的单链互补粘性末端，通过粘性末端的互补作用形成双链环形DNA。这种由粘末端结合形成的双链区段即Cos位点。(2)λ噬菌体DNA的复制（二）λ噬菌体的类型插入型载体替换型载体(三)λ噬菌体载体的