基因工程(上)DNA重组技术的基本工具、基因工程的基本操作程序(选修3)

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1、专题1基因工程【基础知识梳理】一、基因工程的工具1、基因工程的概念：按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。2、DNA重组技术的基本工具（1）限制酶全称：限制性核酸内切酶来源：主要从原核生物中分离纯化出来特点：识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。结果：产生黏性末端或平末端（2）DNA连接酶类型：根据酶的来源不同，可分为E·coliDNA连接酶和T4

2、DNA连接酶作用：连接双链DNA片段，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二脂键。（3）载体种类：通常利用质粒作为载体，另外还有λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等质粒：化学本质：小型环状DNA分子特点：能自我复制有一个至多个限制酶切割位点有特殊的标记基因20二、基因工程的基本操作程序1、目的基因的获取途径（1）目的基因：编码蛋白质的结构基因。（2）获取目的基因的方法：从基因文库中获取利用PCR技术扩增目的基因通过DNA合成仪人工合成（3）PCR技术扩增目的基因①原理：DNA双链复制②过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链；第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；第三步

3、：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。2、基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。（1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。（2）组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因（如抗生素基因）20①启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。②终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。③标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基

4、因是抗生素基因。3、将目的基因导入受体细胞生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法显微注射技术Ca2＋处理法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程将目的基因插入Ti质粒的T—DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA→表达将含有目的基因的表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→微生物细胞壁的通透性增加→重组质粒与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子4、目的基因的检测与鉴定（1）利用DNA分子杂交技术检测目的基因的有无（2）利用分子杂交技术检测目的基因的转录20（3）利用抗原—抗体杂交检测目的基因的翻译（4

5、）利用个体生物学水平的检测鉴定重组性状的表达【要点名师透析】一、基因工程的工具1、与DNA有关的酶（1）四种酶的比较(2)限制酶和DNA连接酶之间的关系图示2.载体(1)作为载体的条件①能在宿主细胞中稳定保存并大量复制。②有一个至多个限制性核酸内切酶切割位点，以便与外源基因连接。③具有特殊的标记基因，便于筛选。(2)种类①质粒：一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。②λ噬菌体的衍生物。20③动植物病毒。(3)作用①作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内；②利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。二、基因工程的基本操作程序1.目的

6、基因的获取(1)直接分离法：从自然界已有的物种中分离，如从基因组文库或cDNA文库中获取。(2)人工合成目的基因①如果基因比较小，核苷酸序列又已知，可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。②以RNA为模板，在逆转录酶的作用下人工合成。2.基因表达载体的构建(1)基因表达载体各个组成的作用20①启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。②终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端，能使转录在所需要的地方停下来。③标记基因：作用是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因

7、的细胞筛选出来，如抗生素抗性基因。(2)基因表达载体的构建步骤3、将目的基因导入受体细胞受体细胞：细菌↓氯化钙细胞壁的通透性增大↓重组质粒进入受体细胞↓目的基因随受体细胞的繁殖而复制4、目的基因的检测与鉴定(1)分子水平检测①导入检测：DNA分子杂交技术，用放射性同位素标记的含目的基因的DNA片段作探针。20②转录检测：分子杂交法，用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。③翻译检测：抗原─抗体杂交法。(2)个体生物学水平鉴定：对转基因生物进行抗虫或抗病的接种实验，以确定