基因工程的理论基础与基本技术1

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1、第二节基因工程的基本技术1、有毒试剂基因工程实验安全溴化乙锭（EB）：DEPC(焦碳酸二乙酯):强有力的蛋白质变性剂丙烯酰胺：有毒，影响中枢神经系统过硫酸酸铵：对粘膜和上呼吸道、眼睛和皮肤有较大危害性，吸入可致命。2、紫外线紫外分析仪紫外灭菌3、放射线放射性同位素氯化铯：（重金属）可因吸入、咽下或皮肤吸收而危害健康。甲醛：毒性较大且易挥发，也是一种致癌剂酚、氯仿：蛋白质变性剂4、转基因生物5、水电安全需注意防止污染1、微生物污染2、DNA、RNA污染3、其他污染仪器的正确操作微量移液器离心机灭菌锅蒸馏水器电子天平由于提取DNA的目的、种类、所用的生物、组织材料、实验条件等

2、不同，DNA的提纯有很多方法。一DNA的提取与纯化（一）、质粒DNA的提取plasmidDNAThegenomicDNAofE.coli:asinglecirculardouble-strandedDNA,withthecontourlengthabout850timeslongerthanthecell.GenomicDNA闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；（1）原理1.碱抽提法提取质粒DNADNA双链变性DNA单链复性强碱中性染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀

3、下去。变性（2）所用的试剂作用①溶菌酶能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的-1，4糖苷键。在碱性条件（pH>8）下有活性。②葡萄糖增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。③EDTAMg2+、Ca2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。④NaOH-SDSNaOH：强碱，提供pH>12的碱性条件，使DNA双链变性。SDS:溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白—SDS”复合物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到4.8。用来中和NaOH变性液，使DNA复性。高浓度的NaAc有利于变性的大分子（蛋白

4、质、DNA、RNA等）沉淀。用于沉淀DNA。⑥乙醇DNA用于沉淀DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。⑤NaAc-HAc缓冲液⑦RNaseA降解RNA。以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。⑧TE缓冲液DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制。Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲业），有利于以后操作；EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。但苯酚会残留在DNA溶液中。（现多用各种商品化的层析柱纯化DNA)。⑨酚-氯仿选用以上试剂有商业试剂盒；也可以自己配制。（

5、3）碱抽提法提取质粒DNA的步骤SolutionI的配制：使用“溶液Ⅰ”溶解细菌细胞壁。第一步：溶菌50mM葡萄糖，25mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA，4-5mg/ml溶菌酶，RNaseA溶液II破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。第二步：破膜，蛋白质和DNA变性SolutionII的配制：第三步：中和溶液III使DNA复性、并促使蛋白质-SDS复合物和染色体DNA、RNA沉淀。SolutionIII的配制：0.2NNaOH，1.0%SDS3M醋酸钠（用冰醋酸调pH至4.8）最重要的是：2.影响质粒DNA产量的因素菌株的遗传背景，质粒自身的拷贝数。一般要

6、使用endA基因发生突变的大肠杆菌菌株。如DH5、JM109、XL1-Blue等。（1）受体菌株endA基因编码核酸内切酶Ⅰ，在Mg2+的存在下可将双链DNA消化成7bp的寡核苷酸片断。这是直接决定DNA产量的重要因素之一。（3）质粒大小分子量大的质粒，拷贝数少。（2）质粒拷贝数质粒本身的性质所决定。若干常用质粒的理论产量质粒名分子大小bp拷贝数质粒产量g/mlpGEMpUCpBR322ColE1pACYCpSC101270027004400450040009000300-700500-700>25>15≈10≈61.8-4.12.9-4.1>0.32>0.15≈0.

7、09≈0.12（二）、基因组或其他DNA的提取1.细菌基因组DNA的制备大肠杆菌基因组DNA一般过程及原理：（1）细胞裂解10%SDS和蛋白酶K。37℃温育。不用NaOH!（3）沉淀DNA0.6倍体积的异丙醇。（2）DNA纯化CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)除去多糖，酚-氯仿-异戊醇除去蛋白。苯酚2次酚∶氯仿∶异戊醇25∶24∶11次氯仿∶异戊醇24∶11次一般过程及原理：动物组织剪成小块，置液氮中冻结后研磨成细粉末。组织培养的细胞用胰酶消化松散后直接使用。（1）组织粉碎2.哺乳动物细胞基因组DNA的抽提0.5%SDS和0.1