细胞凋亡过程中细胞骨架改变的激光共聚焦显微镜观察

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1、万方数据第29卷第4期2010年8月电子显微学报JournalofChineseElectronMicroscopySocietyV01．29，No．42010-08文章编号：1000-6281(2010)04-0361-06细胞凋亡过程中细胞骨架改变的激光共聚焦显微镜观察吴波1，高清1，刘琦2，石群立1，孟奎1(1．南京军区南京总医院病理科，2．南京军区南京总医院妇产科，江苏南京210002)摘要：目的：了解细胞凋亡过程中细胞骨架的形态学改变。方法：应用高浓度全反式维甲酸诱导卵巢癌细胞凋亡，激光共聚焦显微镜观察经荧光染色的细

2、胞微管蛋白的形态学变化。结果：凋亡早期，微管蛋白在荧光相由正常按一定方向分布的丝网状结构变成杂乱分布的网状结构，晚期呈细颗粒状分布，荧光强度随凋亡发展而逐渐变弱。讨论：在凋亡过程中，细胞骨架随凋亡发展出现相应的形态学改变，凋亡早期，细胞骨架在分布上出现变化，伴随细胞形态出现变化，凋亡晚期，细胞骨架蛋白发生降解，此时的细胞形态改变是不可逆的。关键词：细胞凋亡；微管蛋白；激光共聚焦显微镜；免疫荧光染色中图分类号：Q2；Q336文献标识码：A细胞骨架在细胞发育及其生物过程中起着相当重要的作用，而微管又是细胞骨架的主要成分之一，其功能

3、包括细胞的支架作用、细胞内运输、形成纺锤体、纤毛与鞭毛的运动等。细胞凋亡过程中细胞形态发生一系列的改变，如细胞表面结构消失、脱落周围细胞群、胞质出芽、凋亡小体形成等，其本质是细胞骨架的作用。本实验通过激光共聚焦显微镜，观察细胞凋亡过程中微管结构的形态改变。1材料和方法1．1细胞培养和处理卵巢低分化腺癌CAOV3细胞株由浙江大学附属妇产医院馈赠。全反式维甲酸(a11．transretinoieacid，ATRA)受赠于解放军医学科学院任蕴芳研究员(购自Sigma公司)，应用时以无水酒精溶解，避光保存。细胞复苏后加入含10％胎牛血

4、清、2mmoL／mL的左旋谷氨酰胺、100U／mL青霉素及100ms／mL链霉素的RPMll640培养基中，370C，5％CO：，湿度100％的培养箱悬浮培养，细胞密度约为5x105／mL，对数生长期收获细胞，离心(1000rpm，5min)，PBS洗涤去上清液，吸少量液体滴在玻片上涂片，自然凉干后纯丙酮固定，作为对照组，4。C冰箱冷藏备用。实验组细胞在生长期分别加入10、20、30、50pmoL／mL浓度的全反维甲酸(ATRA)，培养72h，每收稿日期：2009．12-29作者简介：吴波(1961一)，男(汉族)，江苏人，副

5、主任医师24h观察1次，平均2～3天用0．25％胰蛋白酶和0．02％EDTA消化传代。取出培养细胞，1000r／rain离心，用PBS漂洗2遍，细胞涂片凉干后纯丙酮固定，4℃冰箱冷藏备用。1．2试剂一抗：小鼠抗人Tubulin—Ot单克隆抗体(克隆号：DMIA，工作效价1：100)，购自福建迈新公司；二抗：FITC标记山羊抗小鼠IgG(购自美国Sigma公司，工作效价1：100)，碘化吡啶(PI)均购自pharmigen公司，牛血清白蛋白(BSA)、tritonX·100、RPMll640、胎牛血清均购自GIBCO公司。1．3

6、荧光染色免疫荧光染色：(1)细胞涂片用三蒸水漂洗×3次；(2)10％正常山羊血清(0．01moL／LPBS稀释)封闭，室温孵育30rain；(3)滴加小鼠抗人Tubulin—a一抗，37％孵育lh；(4)PBS冲洗5rain×3次；(5)滴加混合的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔二抗，室温反应1h；(6)PBS冲洗5rain×3次，90％甘油封片，切片在荧光显微镜下观察，细胞有阳性着色后放置在激光共聚焦显微镜下观察。所用的载玻片和盖玻片尽可能薄，玻面光洁，厚度均匀，使用前应清洁液、乙醇液、蒸馏水泡洗，以消除杂质荧光。盖玻

7、片覆盖标本后立即用无标本腐蚀作用的缓冲甘油封片，甘油要求没有自发荧光。1．4HE染色及光镜观察万方数据362电子显微学报J．Chin．E]ectr．Microsc．Soe第29卷为了证实ATRA诱导培养细胞的凋亡发生，对照组及实验组的细胞涂片，均进行常规HE染色，光镜观察。1．5共聚焦激光扫描显微镜观察荧光染色的细胞涂片在Bio．Rad公司生产的Axiovers-100型共聚焦激光扫描显微镜采集图像，以氩一氪激光为激光光源，激发光为FITC，在518rim波长以上观察，物镜镜头为消色差平场40倍油浸镜头，数值孔径为1．0。光学

8、切片时，Axiovers荧光显微镜的微调由CLSM软件所控制，光切片步距为0．3—0．8mm，图像采集为512X512像素，微管标记阳性呈绿色荧光。为控制其他因素对观察结果的影响，保持激光电压在扫描时相对稳定，激光电压和增益一致以及扫描头接收光波波谱范围一致的前提下，扫描细胞