细胞骨架的观察

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1、细胞骨架的观察生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室1.实验目的熟悉免疫化学方法的原理及操作步骤。掌握掌握考马斯亮蓝R250染色法及观察细胞内微丝的方法。掌握用间接免疫荧光法显示细胞内微管的方法。生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室2.实验原理2.1免疫组织化学技术2.2细胞骨架的观察生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室2.1免疫组织化学技术免疫组织化学(Immunochistochemistry)是利用免疫学抗原抗体反应的原理，用带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对组织细胞内特定抗原进行定性、定位和定量研究的一项新技术，又称免疫细胞化学

2、(immunocytochemistry)。免疫组织化学技术具有特异性强、灵敏度高、定位准确和简便快速等优点，又能够同形态、功能及代谢等研究结合起来，用以研究其它技术（如化学、生化、免疫及生理等）难以深入的领域。生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室免疫组织化学的过程（1）抗原的提取与纯化；（2）免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；（3）将显色剂与抗体结合形成标记抗体；（4）标本的制备；（5）免疫细胞化学反应以及呈色反应；（6）观察结果。生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室免疫荧光法免疫荧光法分为直接法和间接法。直接法：将荧光素（最常用异硫氰酸荧光素、FITC）标记在

3、特异性抗体上，使其直接与细胞上相应抗原结合，在荧光显微镜下观察即可鉴定未知抗原。间接法：将荧光素标记在第二抗体上，待一抗与细胞抗原结合后，再用标记了的二抗与一抗相接，从而显示未知抗原。间接免疫荧光法中具有2对抗原、抗体系统。生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室2.2细胞骨架的观察细胞骨架(cytoskeleton)是真核细胞细胞质中错综复杂的蛋白质纤维网络，按纤维直径、组成成分和组装结构的不同分为微丝(microfilaments，MF，5～7nm)、微管(microtubule，MF，20～25nm)和中等纤维(intermediatefila

4、ments，IF，8～11nm)。目前观察细胞骨架的手段主要有电镜、间接免疫荧光技术、酶标、组织化学等。生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室微丝的观察—考马斯亮蓝法考马斯亮蓝R250是一种普通的蛋白质染料，它可以使各种细胞骨架蛋白质着色，并非特异地显示微丝，但是由于有些细胞骨架纤维在该实验条件下不够稳定，例如微管；还有些类型的纤维太细，在光学显微镜下无法分辨，因此我们看到的主要是微丝组成的张力纤维，直径约40nm左右。实验中用1％TritonX—100可抽提掉胞质中除骨架蛋白以外的其他蛋白，能清晰地显示微丝束。生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室微丝的观察—荧光法用荧光染料甲基罗丹

5、明标记的鬼笔环肽处理后，可在荧光显微镜下看到微丝动态变化的图象。生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室微管的观察—免疫组织化学法用抗管蛋白的免疫血清(一级抗体，例如兔抗管蛋白抗体)与体外培养细胞一起温育，该抗体将与胞质中的微管(抗原)特异结合，然后再加荧光素标记的抗球蛋白抗体（二级抗体），例如异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔抗体共同温育，该二级抗体与一级抗体结合，从而使微管间接地标上荧光素。置荧光显微镜下用一定波长激发光照射即由荧光所在显示出微管的形态和分布。生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室2.实验材料、用品实验材料：培养的Hela细胞实验用品：①实验器材：光学显微镜，荧光

6、显微镜，冰箱(—20℃及4℃)，小型振荡器，温箱，细胞培养设备；平皿，直径30mm小染缸，载玻片，盖玻片，铝盒等。②主要试剂M—缓冲液，1%TritonX—100（用M—缓冲液配制），0.2%考马斯亮蓝R250，3.0%戊二醛（用0.2mol/L磷酸盐缓冲液配制），3.7%甲醛—PEMD，甲基罗丹明—鬼笔环肽染液。PEM缓冲液，PEMP缓冲液，PEMD缓冲液，兔抗管蛋白血清（一抗），FITC-羊抗兔抗体（二抗），甘油-PBS(9:1，pH8.5-9.0)。生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室4.实验步骤微丝的观察—考马斯亮蓝法①细胞培养在平皿中的盖玻片上，生长密度达++～+++时，取出

7、盖玻片，用PBS洗3次。②用1%TritonX—100处理25—30min，室温或37℃均可。③立即用M—缓冲液轻轻洗细胞3次。④略晾干后，用3%戊二醛固定细胞5-15min。⑤PBS洗数次，滤纸吸干。⑥用0.2%考马斯亮蓝R250染片30min-1h。然后小心用水冲洗，蒸馏水冲洗，空气中略干燥。⑦普通光学显微镜下用40×物镜或油镜观察。生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室4.实验步骤①细胞培养在平皿中的盖玻片小条上