实验七细胞骨架观察

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1、细胞骨架组分的荧光染色观察实验目的掌握细胞骨架的显示方法掌握荧光显微镜的使用方法了解荧光显微镜下细胞骨架的基本形态结构背景知识细胞参量荧光探针吸收/发射nm特性DNA和RNAPropidumiodide(PI)535/617红色荧光嵌入核酸双链间,只能标记死细胞.用于染色体,细胞观察,分辨死活细胞和细胞周期研究Ethidiumbromide(EB)518/605红色荧光嵌入核酸双链间,只能标记死细胞.用于电泳分析,染色体观察DAPI358/461蓝色荧光半通透细胞,结合于DNA的AT碱基对.用于细胞周期的研究,染色体和细胞核的观察

2、Hoechst33342350/461蓝色荧光结合于DNA的AT碱基对,可进入活细胞,用于细胞周期的研究,染色体和细胞核的观察蛋白和抗体的耦联探针FITC494/518绿色荧光染死细胞,对PH值变化不敏感Texasred595/615红色荧光多参量细胞标记溶酶体Neutralred541/640红色荧光探针微偏碱性,可标记溶酶体等酸性细胞器线粒体Rhodamine123507/529黄绿色荧光可进入活细胞,阳离子性,摄入快,淬灭快,无毒性常用荧光探针介绍狭义的细胞骨架指细胞质骨架，包括微丝、微管和中间纤维。广义的细胞骨架包括细胞核

3、骨架、细胞质骨架、细胞膜骨架和细胞外基质。细胞骨架2021/9/9微管2021/9/9微丝2021/9/9中间纤维背景知识S.D.Pone用考马斯亮蓝染人皮肤成纤维细胞的细胞骨架获得成功。1982年上海植物生理所陈梓卿采用植物细胞为材料也获成功。实践证明这是一种简单易行的方法。当细胞用适当浓度的tritonX-100溶液（聚乙二醇辛基苯基醚，一种非离子去垢剂）处理，能够溶解质膜结构中及细胞内许多蛋白质，而微丝束结合得比较紧密，不容易被去除，经固定和染色后，可在光镜下观察到由微丝组成的纤维束。细胞骨架研究中常用药物药物名称作用细胞松

4、弛素B(cytochalasinB,CB)结合在微丝的正端，阻抑其聚合，同时提高临界浓度，最终导致微丝的解聚鬼笔环肽(phalloidine)强烈亲和微丝，结合在微丝中actin亚单位之间，稳定微丝、促进微丝聚合秋水仙素（colchicine）阻断微管蛋白组装成微管紫杉醇（taxol）促进微管的装配，稳定已形成的微管实验原理鬼笔环肽(phalloidin)是从一种毒性菇类中分离的剧毒生物碱，它同细胞松弛素的作用相反,只与聚合的微丝结合,而不与肌动蛋白单体分子结合。它同聚合的微丝结合后,抑制了微丝的解体,因而破坏了微丝的聚合和解聚的

5、动态平衡。由于鬼笔环肽非常特异地结合并稳定聚合态肌动蛋白,因而对肌动蛋白的动态平衡造成严重影响.此外,较高浓度的鬼笔环肽对细胞有毒害作用.因此,用鬼笔环肽标记微丝并不是用于研究活体细胞的理想方法.G-actinF-actinATP、Mg2+、高K+、Na+Ca2+、低Na+、K+实验步骤材料：CHO（中国仓鼠卵巢细胞）、鸡胚成纤维细胞试剂：1.PEM：50mMpipes(pH6.9),5mMEGTA,5mMMgSO4,0.225M山梨醇2.0.5%TritonX-100溶于PEM缓冲液中。3.4%多聚甲醛溶于PEM缓冲液中。取出盖

6、片，于小平皿中37℃预温PEM洗3次(每次1mL)TritonX-100处理约10min(1mL)37℃预温PEM洗3次(每次1mL)37℃预温4%多聚甲醛固定细胞15min(1mL)37℃预温PEM洗3次55nMAlex-phalloidin10L湿盒中室温染色30min。37℃预温PEM洗数3次滴加10LHo.33342复染色用小砂轮切去长方形盖玻片的一角作为标记以便识别细胞面。细胞密度60-80%注意盖玻片的正反面切勿产生气泡！在parafilm膜上加PEM，待盖玻片被冲起后，再轻轻揭下盖玻片。避光操作荧光镜下观察注意事

7、项注意不要弄碎盖片，分清细胞所在面；各步洗细胞要轻，勿使细胞脱落；荧光观察注意避光操作节约试剂。思考题PEM缓冲液的作用是什么？0.5%TritonX-100处理细胞的作用是什么？鬼笔环肽用于细胞骨架研究的优缺点是什么？