巨鹿金银花RAPD分子鉴别技术的研究.pdf

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1、第28卷第2期邢台学院学报Vol.28,No.22013年06月JOURNALOFXINGTAIUNIVERSITYJun.2013巨鹿金银花RAPD分子鉴别技术的研究牛伟涛，曹萌（邢台学院，河北邢台054001）摘要：巨鹿县金银花在国家工商总局成功注册金银花原产地标志。实验旨在为巨鹿金银花建立一套分子生物学技术鉴别方法，以快速准确的鉴别巨鹿金银花的真伪，同时也对中药材基因资源的多样性起到保护作用。RAPD技术是一项重要的分子标记技术，常用于DNA指纹图谱的构建。实验通过SDS方法提取出产地的金银花基因组DNA，采用10个随机引物用于RAPD-PC

2、R反应。成功构建了巨鹿金银花DNA指纹图谱；筛选出引物1可快速准确的将巨鹿金银花与其他两产地金银花鉴别区分。利用RAPD技术可准确鉴别出巨鹿金银花，为中药材鉴别提供了新的技术方法。关键词：巨鹿金银花；RAPD技术；DNA指纹图谱；鉴别方法中图分类号：Q75文献标识码：A文章编号：1672-4658(2013)02-0190-03随机扩增多态DNA(Randomamplifiedpoly-基（上海）贸易有限公司生产合成。morphicDNA，RAPD)技术是一种比较通用的DNA指2实验方法与过程纹图谱技术，它是Williams和Welsh两个研究小2

3、.1金银花基因组DNA的提取[1-2]组几乎同时于1990年建立起来的。RAPD是建金银花组织各1g，研钵中快速研磨。研磨立于PCR基础之上的分子标记技术，基本原理是利后转至1.5ml离心管中，各3管，加1ml细胞提取用一个随机引物(8～10个碱基)通过PCR反应非定缓冲液，混匀后，65℃的水浴40min。水浴后，点地扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分离扩增片段加200ul5mol/L的KCl溶液，混匀，冰置20min。[3]来进行DNA多态性研究。然后，12000r/min，4℃离心10min。取上清，金银花（LoniceraeJaponicaeT

4、hunb.），为加等体积氯仿∶异戊醇（24∶1），混匀后，12000中药材和植物的统称。植物金银花又名忍冬，为忍r/min，4℃离心10min。取上清，加等体积氯仿，冬科多年生半常绿缠绕木质藤本植物。作为药材的混匀，12000r/min，4℃离心10min。取上清，[4]金银花，是其干燥花蕾或待初开的花。金银花作加等体积冷异丙醇，混匀后，-20℃放置30min。为我国名贵中药材之一，具有清热解毒、凉散风热、12000r/min，离心10min，弃上清，用70％的乙[5-8]消炎退肿、保肝抗病毒、延缓衰老等功效。醇洗涤3次，自然干燥5min。加入20

5、0ulTE，溶巨鹿是“河北金银花之乡”，据清光绪版《巨解DNA，加入2ulRnase，混匀后，37℃水浴1h。鹿县志》记载金银花为中药材种植之首，自明代就加等体积氯仿∶异戊醇（24∶1），混匀，12000有栽培，迄今已有400多年历史。2010年巨鹿县r/min，15℃离心10min。取上清，加入1/10体积金银花在国家工商总局成功注册金银花原产地标志，3mol/LNaAc，两倍体积的冷异丙醇，-20℃放置申报了“中国金银花之乡”。金银花产地、品种不20min，10000r/min，15℃离心10min。弃上清，同，所具有的基因也不同，本研究尝试利

6、用随机扩70％的乙醇洗涤2次，干燥后溶于200ulTE，-20℃增多态DNA(Randomamplifiedpolymorphic保存备用。DNA，RAPD)技术对巨鹿金银花建立一套分子生物学2.2DNA的质量鉴定技术鉴别方法，以快速准确的鉴别巨鹿金银花的真1.0％的琼脂糖凝胶电泳，每孔上5ul样品，伪，同时也对其他中药材鉴别方法提供借鉴。胶板上含有0.1ug/ml的EB，用0.5×TBE电泳缓1实验用品冲液(pH8.0），80v恒压电泳40min后，用凝胶TC-96/G/H（b）基因扩增仪（杭州博日科技有成像分析系统观察记录电泳结果。各区取样品1

7、ul限公司）；超微量核算蛋白分析仪（北京五州东方通过核酸蛋白微量检测仪DNA浓度与纯度。科技发展有限公司）；TG16-WS台式高速离心机2.3PCR-RAPD扩增（湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司）；ZX-PCR-RAPD反应体系：2×PowerTaqPCRMas-2020D凝胶成像分析系统（上海知信实验仪器技术terMixⅡ代12.5ul，随机引物1ul,800ng/ul公司）等。巨鹿金银花，山东、河南金银花干药材。模板1.5ul，双蒸水10ul。PCR试剂盒北京百泰克生物技术有限公司生产的2×PCR-RAPD扩增程序：95℃预变性5min；94℃

8、PowerTaqPCRMasterMixⅡ代；随机引物英潍捷变性1min，35℃退火45s，72℃延伸1min，[收稿日期