单分子荧光检测技术.pdf

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1、分子发光分析单分子荧光检测技术涂熹娟B200425010【摘要】单分子检测技术有别与一般的常规检测技术，观测到的是单个分子的个体行为，而不是大量分子的综合平均效应。近年来随着相关学科的技术进步，单分子研究已经在从分子生物学到细胞生物学等生命科学领域有了迅速的发展和应用。本文简要介绍了单分子荧光检测技术的研究背景、意义、原理，以及该项技术进展和应用。【关键词】单分子荧光寿命荧光偏振单分子FRET1.单分子检测技术的意义和发展背景1.1单分子检测技术的意义在统计力学的各态遍历假设中，系综个体物理量轨迹的时间平均等于该物理量在

2、[1]给定时间的系综平均。在一个包含完全相同个体的系综，当测量时间足够长的时候，系综测量和单分子测量结果相同（例如对于稀溶液中小分子的核磁共振谱线的测定，由于测量时间远大于小分子的翻滚时间，这时体系就可以看成是一个均匀的体系，并看作静态）；但是即使在均相体系中，分子本身并不是处于静态，而是在不断地运动，测量的参数具有涨落现象，而测量时间可能会小于分子的涨落时间；另一种情况是在非均相体系中，个体轨迹平均本来就不等于系综平均（实际上几乎所有生物体系都不是均相体系）。这以上考虑到的两点都导致系综测量结果和单分子测量结果不等。一

3、般系综测量结果表示的是大量由一种或多种对象组成的一个整体所表现出来的平均效应和平均值。这一平均效应掩盖了许多特殊的信息。而这些特殊的信息有时是非常涂熹娟B200425010分子发光分析重要的，尤其在研究具有非均匀特性的凝聚相物质和生物大分子结构时。而相比之下，单分子检测就可做到对体系中单个分子的行为进行研究，可以得到在特定时刻，特定分子的特殊位置和行为，因为在某一时刻，集团中的任何成员只能处于一种状态。将此再与时间相关，还可得到单个分子的行为的分布状况。这样我们就可以同时得到所研究的对象的整体行为和个体行为了，然后将数据

4、综合处理，得到更为全面的信息。1.2单分子检测技术的意义和发展背景既然单分子检测技术有这么多的好处，为什么直到近年来才逐渐发展起来呢？这与光学系统的进展有很大的关系。其实人类很早以前就有探索微观世界奥秘的要求，但是苦于没有理想的工具和手段。直到世界上第一台可以被称为显微镜的仪器在1675年由荷兰生物学家列文虎克制作出来。在以后的几百年，人们一直用光学显微镜观察微观和探索眼睛看不到的世界，但是光具有波动性使光学显微镜的分辨率只能达到光波的半波长左右，人类的探索因此受到了限制。即使消除掉透镜形状的缺陷，任何光学仪器仍然无法完

5、美的成像。人们花了很长时间才发现，光在通过显微镜的时候要发生衍射，即物体上的一个点在成像的时候不会是一个点，而是一个衍射光斑。如果两个衍射光斑靠得太近，你就没法把它们分辨开来。显微镜的放大倍数再高也无济于事。对于使用可见光作为光源的显微镜，它的分辨率极限是0.2微米。任何小于0.2微米的结构都没法识别出来。提高显微镜分辨率的途径之一就是设法减小光的波长，或者，用电子束来代替光。根据德布罗意的物质波理论，运动的电子具有波动性，而且速度越快，它的“波长”就越短。如果能把电子的速度加到足够高，并且汇聚它，就有可能用来放大物体。

6、进人20世纪，光电子技术得到了长足的发展，1938年，德国工程师MaxKnoll和ErnstRuska制造出了世界上第一台透射电子显微镜（TEM）。几十年来，又有许多新型的显微镜问世，1952年，英国工程师CharlesOatley制造出了第一台扫描电子显微镜（SEM）。电子显微镜是20世纪最重要的发明之一。由于电子的速-9度可以加到很高，电子显微镜的分辨率可以达到纳米级（10m）。很多在可见光下看涂熹娟B200425010分子发光分析不见的物体——例如病毒——在电子显微镜下现出了原形。用电子代替光，这或许已经是一个反常

7、规的主意，但是还有更令人吃惊的：1983年，IBM公司苏黎世实验室的两位科学家GerdBinnig和HeinrichRohrer发明了所谓的扫描隧道显微镜（STM）。这种显微镜比电子显微镜更激进，它完全失去了传统显微镜的概念。正是近年来这些在光谱学和光学显微镜方面的进展，使得在表面和溶液中检测和成像单分子成为了可能，而且可以对单分子的光谱性质进行检测并实时监控其动态过程。使得我们终于可以看清单个分子与时间相关的行为，排除测量中的平均效应，发展单分子检测技术。2.单分子检测技术的原理2.1单个分子的荧光产生原理Fig.1单

8、个分子的荧光产生原理[2]单分子的荧光产生原理如Fig.1所示：S0，S1，S2分别为基态、第一激发单重态、第二激发单重态，T1为激发三重态。分子吸收一个光子hνA后，被激发到较高的电子态S1或S2以上的能级后又快速弛豫到S1的最低振动能级，然后发射一个荧光光子ｈνF，同时使分子弛豫到S0的较高振动能级，最后快速弛豫