荧光及其荧光单分子跟踪技术

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1、荧光及其荧光单分子跟踪技术2011.11鄢志丹荧光什么是荧光；分子荧光的主要特性有那些；荧光显微技术荧光显微镜；探测传感器；荧光显微技术的应用领域；荧光单分子检测技术单分子检测意义；荧光单分子检测特点、应用范围和关键技术；一种高精度快速的荧光单分子跟踪算法图像去噪；位置估计；伪点剔除；精细定位；轨迹生成；特性评价；真空设备；总结及思考题主要内容:思考题思考题1、什么是荧光？它有哪些主要特点？2、荧光如何从激发光中分离出来，它有那么主要的探测器件？3、单分子检测的应用领域有哪些？4、单分子跟踪算法分为几个重要步骤？5、IDGM（图像去噪高斯掩膜）与2DDGF（二维直接高斯拟合）算法相

2、比，有什么优势？6、荧光显微技术如何实现与真空分子生长（蒸发）技术的耦合？荧光荧光（1852年，英国科学家Stokes)：1/5：荧光（Fluorescence）光致发光：某些分子受外界可见光或紫外线激发而出射光子的现象；荧光和磷光：激发态电子排布和光子发射路径不同；荧光发射过程：吸收、内转移、振动驰豫、荧光发射磷光发射：系间窜越分子荧光发射能量图光致发光分子荧光特性：1/5：荧光（Fluorescence）量子跳跃特性：发射——暗态交替的量子跳跃过程；在实验中可观察到单分子荧光强度和荧光光谱的涨落；荧光偏振特性：单个荧光分子因其具有唯一的固有荧光和吸收跃迁偶极矩，因而只吸收那些偏

3、振方向与其吸收跃迁偶极矩方向一致的光子，并发出具有一定偏振方向的荧光；Stokes平移能量间隙Stokes平移：发射光谱和激发光谱；荧光发射光谱较之激发光谱会产生红移；分子荧光特性：1/5：荧光（Fluorescence）荧光饱和和荧光淬灭：荧光饱和：当激发光强增加到一定程度后，若持续增加激发光强，发射的荧光强度不但不增加，反而会减小。荧光淬灭：荧光分子在与某些物质作用下，出现发射荧光减弱甚至消退的现象。真空中的p-6P分子连续荧光光谱p-6P分子荧光光谱淬灭荧光低温特性：在低温环境下，由于分子的转动能、振动能及其多普勒效应大大减少，其荧光量子产量和荧光强度增大，荧光寿命增加，荧光

4、发射光谱半峰全宽（FWHM）变窄。不同温度下的p-6P分子荧光光谱荧光显微技术荧光显微镜家族：种类繁多，包括落射式荧光显微镜、全内反射式荧光显微镜、激光扫描共焦显微镜、驻波荧光显微镜、受激发射损耗荧光显微镜等；激发样品方式不同，但荧光分离原理近似；基本原理：利用荧光滤镜组出射一定波长的激发光激发样品以产生荧光（比激发光波长长），该荧光被物镜采集后，再次经由荧光滤镜组消除不是荧光波长的其他光，最终使荧光到达光学传感器。落射式荧光显微镜2/5：荧光显微技术（FluorescenceMicroscopy）特点：高灵敏度、高分子选择性、高信噪比；荧光滤镜组：把微弱的荧光从激发光中分离出来。

5、2/5：荧光显微技术（FluorescenceMicroscopy）结构图光谱图激发滤镜的带通波长范围必须是分色滤镜和发射滤镜的阻碍波长范围，而发射滤镜的通过波长范围在分色滤镜的通过波长范围之内；荧光滤镜组的选择要针对所观测分子，须明确其激发光谱和荧光发射光谱特征。探测传感器：2/5：荧光显微技术（FluorescenceMicroscopy）光谱探测：光谱仪（Spectrometer）工作原理光谱仪通常由棱镜或衍射光栅等构成，可将成分复杂的入射光分解为不同频率-光强的光谱线；单色、多色之分。实物图光强探测：光电倍增管(PhotomultiplierTube,PMT)实物图PMT由

6、光电发射阴极、聚焦电极、电子倍增极及电子收集极（阳极）等组成，它是具有极高灵敏度和超快时间响应的光探测器件。图像探测：电荷耦合元件（ChargeCoupledDevice,CCD）工作原理CCD能将光学信息转化为数字信号，具有低噪声、高灵敏度等特性；黑白、彩色；数字、模拟之分。实物图荧光显微技术应用领域：2/5：荧光显微技术（FluorescenceMicroscopy）荧光显微技术生物细胞观察细胞的形态和数量鼠脑羊肺材料物理观测分子分子生长过程并六联苯纳米纤维生长生物化学观察化学反应过程发出绿色荧光的老鼠药学医学确定样品成分石油地质等烃类成分和含量、及在岩石中的存在方式等油质沥青

7、发黄、白、绿、蓝等色荧光，为石油组分中的烃类化合物；胶质沥青以橙色荧光为主，为含氧、氮、硫的烃类；沥青质发褐色荧光，为不溶于石油醚的胶质沥青、非烃及沥青质。荧光单分子检测技术3/5：荧光单分子检测技术（FluorescenceSingleMoleculeDetection）为什么要进行单分子检测：研究意义1.排除平均效应，得到大量的个体信息2.单分子的特征对局部场的存在非常敏感，可以反映局部微观环境的信息3.能够揭示随时间变化的分子特性有可能观察到未知领域中的新效应，