双分子荧光互补技术(BiFC)

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1、双分子荧光互补技术（BiFC）一、技术简介BiFC是由Hu等在2002年最先报道的一种直观、快速地判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用的新技术[1].有报道在GFP的两个β片层之间的环结构（loop）上有许多特异位点可以插入外源蛋白而不影响GFP的荧光活性，BiFC技术正是利用该荧光蛋白家族的这一特性，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白连接。如果两个目标蛋白因为有相互作用而接近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基因而发出荧光。在荧光显微镜下，就能直接观察到两目标蛋白是否具有相互作用，并且在最接近活细胞生理状态

2、的条件下观察到其相互作用发生的时间、位置、强弱、所形成蛋白复合物的稳定性，以及细胞信号分子对其相互作用的影响等，这些信息对研究蛋白质相互作用有重要意义。其后发展出的多色荧光互补技(multicolorBiFC)，不仅能同时检测到多种蛋白质复合体的形成，还能够对不同蛋白质间产生相互作用的强弱进行比较.这项技术不需要特殊的设备，相互作用的蛋白也不需要特别的理论配比。因此，BiFC技术已被国际上众多实验室采用，在活细胞内证明蛋白质的相互作用。本实验室成功应用该技术研究转录因子c-Jun、ATF2和c-Fos在原代神经元中的竞争性相互作用[2]。BiFC技术以下几个特点使其对于

3、研究蛋白质相互作用具有独特的优势：1、能在显微镜下直接观察到蛋白相互作用而且不依赖于其它次级效应；2、该相互作用可以在活细胞中进行观察，排除了由于细胞裂解或固定可能带来的假阳性结果；3、蛋白质在近似生理条件的环境下表达，表达水平及特性如翻译后修饰极大地接近于内源蛋白；4、不需要蛋白质有特别的理论配比，能检测到不同亚群蛋白质间的相互作用；5、多色BiFC技术不仅能同时检测到多种蛋白质复合体的形成，还能够对不同蛋白质间产生相互作用的强弱进行比较；6、BiFC技术除了荧光倒置显微镜外，不要求特殊的设备。实验简单、快捷、直观，并适用于原核、真菌、植物、动物等多种组织、细胞.该技

4、术的完善与发展必然会为蛋白质组学、蛋白质相互作用连锁图的建立带来福音.但是，该技术与大多检测蛋白质相互作用的技术一样，也存在着假阴性和假阳性的问题，需要在实验中仔细验证。二、实验步骤：1.将目的基因插入到含有N片段或C片段的载体中，构建成融合蛋白表达载体2.转染细胞，荧光显微镜下观察是否有相互作用。三、应用实例：Fig1:PotassiumdeprivationincreasesBiFCsignalsformedbyJunVN173andATF2VC155.CGNsweretransfectedwithplasmidsencodingJunVN173(JunVN)and

5、ATF2VC155(ATF2VC)togetherwithECFP.JunΔL3VNwereservedasacontrol.After16hr,CGNswereswitchedto25K,5Kmediafor1h.Photosweretakenonafluorescencemicroscopeatamagnificationof200×.ThewhitearrowsindicatedtheBiFCsignals(Venusfluorescence).ThetransfectedcellswerelysedforWesternblottingbyanti-Flagand

6、anti-ATF2(20F1CST).CFPwerereprobedfornormalizingthetranfectionefficiency.ThepercentageofCFP-positivecellsexhibitingVenusfluorescencewasscored.Datawerepresentedasmeans ± S.E.,n=3,Student’sttest,p<0.05[2].1.Hu,C.D.,Y.Chinenov,andT.K.Kerppola,VisualizationofinteractionsamongbZIPandRelfamily

7、proteinsinlivingcellsusingbimolecularfluorescencecomplementation.MolCell,2002.9(4):p.789-98.2.Yuan,Z.,etal.,OpposingrolesforATF2andc-Fosinc-Jun-mediatedneuronalapoptosis.MolCellBiol,2009.29(9):p.2431-42.