重组毕赤酵母表达瑞替普酶(Reteplase)过程中的降解控制.pdf

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1、第36卷第2期工业微生物Vol.36No.22006年6月IndustrialMicrobiologyJun.2006!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!重组毕赤酵母表达瑞替普酶（Reteplase）过程中的降解控制邹敏l，方曙光l，黄立l，庄英萍l，储炬l，张嗣良l，严成钊2（l.华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海200237；2.上海市工业微生物研究所，上海200233）摘要在利用重组毕赤酵母表达瑞替普酶（Reteplas

2、e）时，遇到了较为严重的蛋白降解。为了抑制Reteplase的降解，分别研究了p~和氨基酸、蛋白胨等添加物对降解的影响。结果表明，摇瓶培养时用氨水调节p~，并将p~恒定在6.5能有效地抑制降解，这一结果在5L罐上也得到了验证，表达量提高到487mg"L。添加0.l%的Leu或Ala和将蛋白胨用量增加至6%时，Reteplase的降解也能得到有效的控制。关键词：p~；氨基酸；蛋白胨；毕赤酵母；rPA瑞替普酶（Reteplase）（简称rPA）是经基因工程内蛋白酶水平决定着表达产物的降解速度。随着重改造的缺失突变体，在t-PA分子

3、原结构的基础上，组蛋白的分泌增加，其它一些细胞内物质如蛋白酶缺失了其中的K、F、E三个结构域，只保留了K及的分泌也增多，在培养基中积累从而造成对重组蛋l2P两个功能区，为单链非糖基化蛋白，由355个氨基白的降解。此外酵母细胞膜上有一种KEX-2样蛋酸组成，分子量为39kd。其主要优点是延长了体内白水解酶，能专一性水解a-因子前体中羧基端的肽半衰期，减少了血浆清除率，降低了出血性等副作键即连续的2个碱性氨基酸（如LysArg，LysLys，用，被认为是第三代安全、有效的溶栓药物。国外上ArgLys），从而使目的蛋白降解。为了提高

4、外源蛋［l］白在发酵液中的稳定性，使其免受蛋白酶降解，可采市产品都是大肠杆菌表达系统获得，以毕赤酵母表达系统表达还未曾有过报道。用以下几种方法：一是改造P.Pastoris表达宿主菌而毕赤酵母表达系统是目前发展最完善且应用株，缺失基因组中主要蛋白水解酶的基因，使目的产最广泛的一个系统。它能高效表达有活性的外源蛋物稳定，或使用己有的蛋白酶缺陷菌株如SMdll68白，且自身杂蛋白表达量低。为了探讨rPA在毕赤（his4，pep4），SMdll65（his4，prbl）和SMdll63［3］酵母中的表达情况，也为了尝试在毕赤酵母细胞

5、中（his4，pep4，prbl）亦可避免产物降解。二是在培表达多半胱氨酸、强疏水性、大分子量的重组蛋白，养液中补加一些富含氨基酸的组分和酪蛋白水解本文对rPA在毕赤酵母中的表达进行了研究，以期物、胃蛋白水解物，提供给酵母细胞蛋白酶过量的底为进一步深入研究外源基因在毕赤酵母中的高效表物，以减少目的蛋白的降解。三是由于P.Pastoris达提供参考。能忍耐较宽的p~范围（p~3.0!7.0），因此可调节要想实现外源蛋白在毕赤酵母中的高效表达，溶液的p~值抑制蛋白水解酶活性，防止目的蛋白就必须在实验设计与具体操作中从多个环节予以重

6、降解。四是降低甲醇诱导表达时的培养温度，Mei［2］［4］视，尽可能达到最优化。其中包括采用合适的培M（2000）等通过将诱导表达时的温度由30C降养基和培养条件，通过提高细胞的绝对总数来提高至25C，半乳糖氧化酶表达量提高了4倍。外源蛋白的产量等。!材料与方法外源蛋白的稳定性也直接影响到基因表达的产量，几乎没有一种高表达蛋白是特别稳定的，宿主菌!"!材料基金项目：国家高技术研究发展计划“863计划”（No.2002AA2l702l，2002AA2Z345l）作者简介：邹敏（l979!），女，硕士研究生。—7—第2期工业微生物

7、第36卷1.1.1菌种稀释倍数。毕赤酵母工程菌P.PastorisGS115rPA-01（细胞干重测定：取1mL发酵液，12000r"min离+，his+，pPIC9），蛋白信号肽序列来自酿酒酵心10min，去上清液，用去离子水洗2次，80C烘干Mut母的!-MF，由北京军事医学科学院提供。称其干重。1.1.2培养基pH测定：采用pH计测定。1.1.2.1摇瓶生长培养基（种子培养基）蛋白电泳：凝胶配方和电泳操作步骤参照《蛋白［5］［7］BMGY培养基（蛋白胨为日本制药工业株式质技术手册》的方法进行。会社生产）。免疫印迹（Wes

8、tern-blotting）：参照《分子克隆实［5］验指南》第二版方法进行［8］。1.1.2.2摇瓶诱导培养基BMMY培养基［9］1.1.2.3分批发酵培养液总蛋白测定：考马斯亮蓝法。［10］用BSM基础盐配成含甘油4%（W"V）和4mL"目的蛋白测定：溶解圈法。［6］蛋白酶