毕赤酵母表达重组羟基化人源明胶的研究

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1、学位论文数据集中图分类号Q812学科分类号180．7110论文编号1001020110124密级公开学位授予单位代码10010学位授予单位名称北京化工大学作者姓名段慧明学号2005080124获学位专业名称生物化工获学位专业代码081703课题来源自选研究方向分子生物学毕赤酵母表达重组羟基化人源明胶的研究论文题目关键词毕赤酵母重组明胶脯氨酸羟化酶羟基化共表达表征论文答辩日期2011．06．02·论文类型应用研究学位论文评阅及答辩委员会情况姓名职称工作单位学科专长指导教师陈劲春教授北京化工大学基因重组评阅人1夺广涛教授清华大学有机化

2、学评阅人2黄迎春教授北京联合大学生物工程评阅人3黄正明教授解放军302医院药学评阅人4王台研究员中科院植物所分子生物学评阅人5戴荣继教授北京理工大学药物化学徽员会拂聋广涛教授清华大学有机化学答辩委员1黄正明教授解放军302医院药学答辩委员2王台研究员中科院植物所分子生物学答辩委员3马润字教授北京化工大学生化工程答辩委员4陈晓农教授北京化工大学高分子材料答辩委员5注：一．论文类型：1．基础研究2．应用研究3．开发研究4．其它二．中图分类号在《中国图书资料分类法》查询。三．学科分类号在中华人民共和国国家标准(GB／T13745-9)《

3、学科分类与代码》中查询．四．论文编号由单位代码和年份及学号的后四位组成。㈣5川6哪2㈣8Ⅲ7舢8iiii●lI哪YL__-______～摘要毕赤酵母表达重组羟基化人源明胶的研究明胶是胶原的热变性和不可逆的化学降解产物，按用途不同可分为照相明胶、药用明胶、食用明胶和工业明胶，作为配料剂、悬浮剂、粘合剂、成型剂等广泛应用于各领域。传统意义上的商品化明胶作为一种屠宰场的副产品，主要通过物理化学方法提取，源于各种品种、来源和年龄的动物(每一批都不同)，经过前处理后，明胶在一系列条件下序列是变化的。这样不同生产批次的明胶不相同并且具有不同的

4、特性，再加上提取出来的明胶具有病毒和朊病毒的潜在污染的风险，难以完全保证其产品安全性，而重组DNA是获得明胶的另一种策略，这种策略通过表达具有特定长度和组成的胶原基因片段直接产生明胶，能够提供具有稳定的和可预测的特性以及具有确切分子组成的明胶。目前重组明胶由于没有引入外源脯氨酸羟化酶基因，因此都未能发生羟化，即使有的物种具有内源羟化能力，但羟化程度较低，从而不能形成坚固的三螺旋结构，在细胞内很容易降解，以至于不能较快地分泌到细胞外。本论文通过引入外源脯氨酸羟化酶基因，构建多基因(明胶基因、脯氨酸羟化酶基因)共表达载体实现了在毕赤酵

5、母中重组羟基化北京化工大学博士学位论文明胶的表达，并且获得了一定羟基化比例的明胶。在构建的载体中，三个独立表达盒串联在一起，每一个表达盒都有自己的启动子和终止子，分别转录出各自的mRNA并翻译出不同的蛋白，同时在每一个表达盒中，我们选用了毕赤酵母的两种强诱导型启动子(PAOXI和PFLDl)分别作为这些基因的启动子元件。主要工作有以下几个方面：1．通过重叠延伸PCR方法合成了一段长约300bp的编码i00个氨基酸(第531-630)的人I型胶原蛋白alpha(1)链明胶基因(Genebank登录号：P02452)；2．成功克隆了构

6、成表达盒中的各个元件，其中PFLDl启动子元件是以毕赤酵母基因组为模板扩增获得，同时用绿色荧光蛋白的表达检测了启动子的功能，QMF信号肽和TT(终止子)元件都是以表达载体pPIC9K直接作为模板分别扩增获得，脯氨酸羟化酶基因(QP4H和B)分别是以含有各自编码基因的cDNA克隆为模板扩增获得；3．重点构建了多基因表达载体，将明胶基因以及脯氨酸羟化酶基因(QP4H和B)同时引入到同一个毕赤酵母表达载体pPIC9K上。首先获得含有各元件的T一载体，然后通过酶切连接方法将相邻的两个含有元件的T一载体依次连接组装在同一个pGEM—T载体上

7、，最后将整个表达框从T载体上切下后移入到表达载体pPIC9K上；摘要4．表达载体用S81I线性化后，经电转化通过基因同源交换，整个表达框被整合到毕赤酵母KM71染色体中，长出的转化子都是甲醇利用慢型，用含有4mg／LG418的MD平板筛选后获得高拷贝菌株，经过甲醇诱导后，目的蛋白具有较强的诱导表达模式，分子量是单体(未羟化的明胶)的三倍左右，蛋白经LC_MS／MS检测与人胶原蛋白I型相匹配，并且检测到在Gly—X—Y三联体的Y位置上大约有66％左右的脯氨酸发生了羟化作用；5．对重组明胶的微生物生产进行了初步的发酵条件优化工作，诱导

8、时间做到第六天时产量还有增长趋势，因此在诱导时间上可能还有进一步增产的空间，甲醇添加浓度以1％(每12小时一次)为最佳浓度。并且对表达的重组明胶进行了鉴定及表征工作。经圆二色谱检测，明胶的二级结构含有61．5％的B转角和38．5％的无规则卷曲，而不