标本固定时间对免疫组化染色结果的影响

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1、诊断病理学杂志2005年6月第l2卷第3期·233·标本固定时间对免疫组化染色结果的影响杨毅，陆江阳(解放军304医院病理科，北京100037)[关键词]标本；固定时间；免疫组化[中图分类号]R361．2[文献标识码]B[文章编号]1007—8096(2005)03—0233—02目前最常用的组织标本固定剂是4％甲醛液，其甲醛醛表17种常用抗体在胃壁组织中的表达结果基交联封闭抗原作用对免疫组化染色的影响是众所周知的。在适宜的固定时间内可使抗原保存完好，固定时间过短或过长则免疫组化染色减弱以至消失。本文选择23个固定时相点的人体

2、正常胃组织标本，用7种常用抗体进行标记，试图进一步证明固定时间对免疫组化染色结果的影响，寻找适用于多数抗原表达的组织固定时间段，为提高免疫组化染色方法的准确性和稳定性提供参考依据。1材料与方法1．1材料外科手术切除的新鲜正常胃壁组织5例。已固定1—10年的陈旧胃壁组织9例。7种常用抗体，分别为CK(AE1／AE3)(DakoM0630)、EMA(ZymedCHI8．0017)、Ⅷ因子(DakoM0616)、Sm．Actin(DakoM0851)、vimentin(DakoM7020)、S一100(MaximMAB—O137)和

3、LCA(ZymedCH18-0166)。显色系统为EnVision+(DakoK4001)二步法试剂。1．2方法1．2．1固定剂40％市售甲醛用自来水配制成4％中性甲醛液。1．2．2固定时间新鲜胃壁组织分别固定0．5、1、2、4、8、12、24、48、72小时及7、14天，1、2、3月后取材；陈旧胃壁标本分别在固定了1—8年及10年后取材。1．2．3标本取材组织块长：1．5cm，宽：0．3cm，厚：胃壁++，强阳性；+，阳性；±，弱阳性；一，阴性。全层。1．2．4制片不同时相的组织标本按相同条件常规脱水包埋，切片4“m，APE

4、S胶片捞片，70℃烤片。3讨论1．2．5免疫组化染色切片常规脱蜡至水；3％双氧水5固定剂对抗原的交联封闭作用机制．一般认为是甲醛的min；O．1％胰酶消化30min；滴加一抗4℃过夜；PBS洗3次；醛基与抗原决定簇的蛋白及侧链上的氨基等一些基团起缩滴加EnVision+试剂，室温30min；DAB显色5min；苏木精衬合反应，使抗原决定簇的空间结构发生改变，致使抗原抗体染胞核；脱水封片后光镜观察结果。反应减弱。影响抗原抗体反应强弱有两个方面：①结构方每种抗体染色时，集中全部时相点切片后一批进行染面：不同抗原的氨基数量多少不同，

5、相临氨基位置远近不同，色，以保证染色没有人为因素干扰。抗原修复和抗体稀释度氨基与醛基交联后封闭其抗原性的强弱亦不同。②抗原活均按市售抗体所附说明书要求操作，其中EMA、Sm．actin不需性方面：固定时间的长短对组织抗原的活性也有很大影响，抗原修复，另5种抗体使用0．1％胰酶消化修复抗原。固定时间越长抗原活性越低。针对抗原遮蔽可以用抗原修2结果复的方法来解除部分交联，增强免疫反应，在这方面已有较在不同固定时间条件下，胃壁各种组织成分对相应的7多研究报道。。本实验研究发现：在组织固定1小时至数种临床常用抗体均有不同程度的表达。E

6、MA与CK表达上年内，多数组织成分对其相应抗体有阳性表达。但固定时间皮细胞(图1—4)，vimentin表达胃壁平滑肌与纤维组织，Sm．过久则免疫组化染色减弱或消失；抗原不同对甲醛的耐受时actin表达平滑肌组织，Ⅷ因子表达血管内皮，S-100表达胃壁间也不同，短至2周长至6年，经适当的抗原修复后，固定10神经丛，LCA表达胃黏膜淋巴细胞。免疫组化染色结果见年的标本也有抗原的阳性表达。表1。若甲醛固定时间不足会造成抗原弥散及分解，甲醛固定·234·JDiagPathol，June2005，~01．12，No．3剂是一种较强的蛋

7、白交联剂，对绝大多数抗原有很好的固定中参考。作用，若组织固定不及时或固定时间过短，造成组织中甲醛(本文图1～4见插页第58页)浓度太低，则抗原固定不良；乙醇是蛋白沉淀剂，对很多抗原参考文献：起不到很好的固定作用。通过本实验研究发现，使用固定[1]蔡文琴，王伯云．实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术1．5cm长，0．3cm宽，胃壁全层的组织少于1h，则抗原保存较[M]．成都：四川科学技术出版社，1994．10—14．少，免疫组化染色很弱且定位不准；因此，标本离体后应及时[2]StembergerA．免疫细胞化学[M]．北京：原子能

8、出版社，1987．固定，较大的标本应及时切开固定，固定充分后再进行脱水27处理。本研究对固定时间与部分抗原活性的关系进行了较详收稿日期：2004一II一23细、客观的观察，并初步提出实验指标，供病理同道们在工作足月妊娠合并巨大子宫内膜间质肉瘤1例陈玮，许颖，郭宏，成继民(1．