氧化低密度脂蛋白测定方法的探讨.doc

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1、氧化低密度脂蛋白测定方法的探讨作者：汪咏新，热阳古力•努尔麦麦提，廖洪利，姑丽娜尔•依明，田刚【摘耍】目的探讨建立共扼双烯法(CD)测定氧化低密度脂蛋白(OXLDL)对临床诊断的指导意义。方法釆用改进分离低密度脂蛋白的方法，应用CD法与国内通用的ELISA法平行对比，经检测急性心肌梗死(AMI)、不稳定性心绞痛(UAP)、稳定心绞痛(SAP)患者各30例，并与健康人30例比较。结果ELISA法检测OXLDL的结果与CD法之间无相关性，各疾患组血清中LDL氧化形成CD的延迟期显著短于对照组(P均V0.01)o

2、结论阻断LDL的氧化可能成为预防或治疗此类疾患的手段之一。【关键词】氧化低密度脂蛋口；共扼双烯法；ELISA法国外近年研究表明，促动脉硬化的低密度脂蛋口(LDL)可在体内由多种因索形成氧化低密度脂蛋白(OxLDL),从而明显增强其促动脉硬化及促凝的作用。体内OxLDL升高与缺血性心、脑血管病及多种老年病关系密切，已成为国内外医学关注的焦点问题。本研究建立了体外LDL氧化产物共扼双烯(CD)检测法［1］，并对急性心肌梗死（AMI）、不稳定性心绞痛（UAP）、稳定心绞痛（SAP）患者各30例、及健康人30例的氧

3、化易感性进行分析，以探讨应用此方法检测0XLDL的可靠性。资料与方法1•观察对象急性心肌梗死（AMI）患者30例，不稳定性心绞痛（UAP）患者30例,稳定心绞痛（SAP）患者30例，均符合WH01999年诊断标准。取体检及化验指标均正常的30例健康人作为对照组，各组对象均男女各半,年龄在50〜65岁，均同时空腹静脉取血，冷冻备用。2.主要试剂CuS04分析纯;pH7.4的0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）；漠化钾（天津化学试剂三厂出品）；ELTSA测定OxIDL试剂盒；氨基黑10B（AR北京化学试剂厂

4、）；油红“0”（MERCK）。2.方法（1）脂蛋白的分离制备与纯度鉴定清晨空腹静脉采血，常规分离血清。每31111血清加入约lg固体漠化钾（KBr）,此时血清密度为1.30g/ml,在BeckmanT：60转头离心管中铺制不连续密度梯度,于10C超速离心,175000g（50000rpm）,3h［2］o小心吸取出IDL组分，与人血清分别同时进行琼脂糖电泳，分别依氨基黑10B和油红“0”染蛋口质和脂质。（2）酚试剂法蛋白质定量测定方法参照文献［3］。（3）LDL的氧化修饰调整脂蛋白浓度为0.05g/L,加入C

5、uS04溶液（终浓度10mol/L）37°C每隔5分钟于波长234nm测吸光度值共5小时［4］。3.统计学处理实验数据均采用SPSS10.0软件进行统计分析，计量资料以均数土标准差（-±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验，相关性检验采用直线相关分析，P

6、B和油红“0”分别染色后，人血清可见多条染色带，而IDL均只见在相应B脂蛋口位置呈现单…染色带。表明分离的样品已达到琼脂糖电泳纯程度。2.LDL氧化过程曲线脂蛋白内多聚不饱和脂肪酸(PUFAS)被氧化形成共扼双烯(CD),丁波长234nm处有最大吸收峰，用紫外分光光度计连续监测急性心肌梗死(AMI),不稳定性心绞痛(USP)、稳定性心绞痛(ASP)及正常人共120例LDL氧化修饰过程屮CD量随时间变化情况，比较其延迟期时间长短。氧化曲线可以分为三个阶段：&延滞阶段：以延滞时间(min)表示，反映LDL抗氧化

7、能力的大小。b增殖阶段：以最大斜率表示CD最大生成率(nmolCD•mgLDL~l•min-l)oC降解阶段:生成的总CD值(nmolCD/mgLDL)表示，反映LDL氧化程度。2.对照组与疾患组IDL氧化修饰延滞期比较急性心肌梗死组、不稳定性心绞痛组和稳定性心绞痛组，三种不同类型病人延滞吋间明显比对照组缩短（P均V0.01）,其LDL较对照组易于氧化，见表1。表1健康与疾患组W氧化修饰延滞期比较（略）注：各疾患组与对照组比较，P均VO.Olo3.本法的重复性由于血清用量较大，同一份标本反应重复三次，共测5

8、份标本，分别来口各疾患组及健康组标本，记录延迟时间并观察氧化曲线特征。结果批内的延迟时间变异5.6%,曲线特征基本一致。将5份标本分别各分装成5份，-40C冷存。每天取出一份测量，连续五天，结果批间的延迟时间变异9.5%,曲线特征基本一致。5・CD法的延迟时间（min）与ELISA法测定OXLDL的比较经用两种方法平行检测各疾患组每组5例（共20例）及对照组20例，并进行直线相关分析，分析结果r二0.13,P>0