氧化型低密度脂蛋白活化血小板机理初步探讨

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1、复旦大学博士学位论文中文摘要背景：随着社会的发展和人们生活水平的提高、胆固醇摄入的增加，高脂血症及动脉粥样硬化疾病的发病率逐年上升。作为动脉粥样硬化的主要疾病、目前冠心病已成为我国人群死亡的主要病因。已明确动脉粥样硬化斑块的形成及斑块不稳定导致的局部血栓是冠心病、急性冠脉综合征(ACS)发生的重要病理环节，研究已经肯定低密度脂蛋白及血小板在其中扮演主要角色，两者是冠心病研究的重要课题。氧化型低密度脂蛋白(oxidizedlow．densitylipoprotein，ox-LDL)是低密度脂蛋白致动脉粥样

2、硬化的主要活性成份，近期文献报道0X．LDL除致斑块形成外、对血小板活化也有直接的促进作用，在动脉血栓的形成过程中可能发挥重要作用，但具体机制尚缺乏深入研究。因此，研究ox-LDL对血小板活化的影响对阐明冠心病的发病机理、防治ACS临床事件的发生意义重大。作为动脉血栓形成的核心环节，尽管还有许多有待阐明的具体环节，血小板活化的主要步骤已得到充分的研究。研究显示：血小板活化时，其胞膜上的花生四烯酸(AA)在环氧化酶1(COx．1)的催化下合成血栓烷A2(TⅪ也)，后者可扩散到胞膜外进而活化其他血小板。血小

3、板上有两种TXA2受体：TPot和TPD，两者均可与蛋白Gq、G12，13偶联。在血管损伤部位，循环中的凝血酶原迅速生成凝血酶，后者可与血小板表面的蛋白酶激活受体(PARl和PAR4)反应，激活与之偶联的印、G12／13和a蛋白，启动活化过程，并促进血小板胞浆颗粒内容物的释放。其中血小板致密颗粒内的ADP，可扩散到胞膜外激活血小板表面的P2Yl和P2Y12受体，并使偶联的卿和a蛋白发生构型改变。构型改变了的Gq蛋白可激活磷脂酶C(PLC)，后者可催化降解磷酸肌醇生成三磷酸肌醇(D3)和二酰基甘油(DAG

4、)。DAG能够激活血小板内蛋白激酶C(PKC)进而引起蛋白磷酸化，IP3则促进内质网内Ca2+的释放，使胞浆中Ca2+的水平升高。a蛋白可抑制腺苷酸环化酶(AC)的活性并促进P13K的活性。AC活性的下降可降低胞浆环一磷酸腺苷(cAMP)的水平，使磷酸化的血管舒张剂刺激磷蛋白(VAsP)去磷酸化。PBK活性升高可使Akt磷酸化增强，进而通过roTORs并与VASP一起活化CrpnbfllIa受体。G12，13蛋白可与Rho鸟苷酸交换因子(RhoGEFs)结合，诱发Rho因子介导的细胞骨架反应，从而导致血

5、小板形状改变。最后促进血小板的粘附、聚集，导致血小板血栓形成。在上述血小板活化过程中，P2Y12受体占据中心地位，因为其活化不但可以激活血小板，还可以放大和维持TXA2和凝血酶引起的血小板的活化，稳定形成复旦大学博士学位论文的血栓。在研究高脂血症对血小板功能影响的过程中，考虑到高脂血症中最重要的致病因素是OX．LDL，而P2Y12受体在血小板活化中又占有中心地位，因而选择ox-LDL对血小板活性的影响以及ox-LDL是否可通过P2Y12受体促进血小板活化是关键的切入点，对阐明动脉血栓机制具有重要的意义。

6、目的：1．进一步明确ox-LDL对不同血小板活化指标的影响；2．初步探讨OX．LDL活化血小板的具体机制，重点明确OX．LDL是否可通过P2Y12受体活化血小板。方法：通过改良沉淀和硫酸铜氧化法制备OX．LDL。按文献报道，将不同浓度的ox-LDL分别与成年健康者的血小板孵育5分钟后，分别检测ADP诱导的血小板最大聚集率、纤维蛋白原诱导的铺展面积和血小板表面活化的GpIlb／IIIa受体数目，从而观察OX．LDL对上述血小板活化指标的影响。然后通过检测致密颗粒内ADP的释放、P2Y12受体下游信号cAM

7、P、VASP和Akt的水平来初步探讨ox-LDL活化血小板的机制。1．OX．LDL制各和鉴定及血小板的准备：1．1ox-LDL的制备和鉴定：采用改良沉淀法提取人血浆低密度脂蛋白(10wdensitylipoprotein，LDL)，然后以o．01mmol／L的硫酸铜氧化24．48小时制备ox-LDL，以硫代巴比妥酸(thiobarbituricacid，TBA)检测ox-LDL的氧化修饰程度，并以BCA法测定蛋白浓度；1．2血小板的制备：自志愿者肘部静脉取血36ml，以I：6的右旋枸橼酸ACD抗凝，常温

8、3009离心10分钟，分离富血小板血浆，然后9009离心lO分钟，分离血小板，重悬在含0．02U／mLapyrase的苔氏液(Tyrodebuffer)中，并将血小板终浓度调整至2．5×108个／毫升。2．OX．LDL对血小板活化指标的影响2．1以10uM的ADP刺激不同浓度OX—LDL孵育后的血小板，使用双通道血小板聚集仪以lcm／min的走纸速度、测定苔氏液参比下的最大聚集率，观察ox-LDL对血小板聚集率的影响；2．2血小板铺展及面积