基于T-REx系统筛选TTC3可诱导表达的稳转细胞株-论文.pdf

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1、2014年第49卷第7期生物学通报55基于T—REx系统筛选TTC3可诱导表达的稳转细胞株李慧郑馥荔王晓兰(北京师范大学生命科学学院北京100875)摘要位于人类21号染色体唐氏综合征关键区(DSCR)的TTC3基因所表达的蛋白TTC3具有泛素连接酶的活性。其表达异常可能会影响其他蛋白的泛素化水平和降解速率，并可能与唐氏综合征表型发生相关。在前期研究中发现TTC3蛋白在细胞中过表达易形成聚集体。为了在细胞内观察TTC3蛋白的聚集过程，以及该过程对细胞的毒性影响，采用T—REx系统进行TTC3基因稳定转染细胞株的筛选

2、，得到了能够通过四环素诱导蛋白稳定表达的细胞株．解决了瞬时转染的外源质粒进入真核细胞进行相关实验时，质粒丢失和TTC3快速过高表达聚集沉淀的研究难点，对后续研究TTC3蛋白的生理功能有重要意义。关键词诱导表达TTC3唐氏综合征T—REx系统中国图书分类号：Q2—33文献标识码：B蛋白质作为各种生命活动的主要执行者，在蛋白质分子。经软件分析结构相似性可得T／'C3细胞内的水平和活性需要受到严格的调控。由于基因编码的TTC3蛋白(Tetratric0peptiderepeat突变引起的蛋白质水平改变或活性异常可导致癌d

3、omain3)在结构域组成上与CHIP蛋白有较高的症、退行性病变等各种疾病的发生，因此在长期的相似度。进化过程中，生物体内建立了比较完善的质控体T／'C3基因位于21号染色体唐氏综合征(唐系。监测和调节蛋白质的代谢及活性，其中较为重氏综合征是由人第2l对染色体三体变异所造成)要的是分子伴侣和蛋白酶体等系统。关键区域1，被认为是与唐氏综合征表型相关的近年来．研究人员逐渐了解到，分子伴侣辅助一个候选基因。因子使得分子伴侣和蛋白酶体两大系统有机整1996年TI'C3由日本科学家首次发现并报合，协调运作，维护了细胞内蛋白质

4、含量和活性的道[，，随后有实验室证实TFC3特异性表达于人稳态。目前已知的直接参与分子伴侣的几类底物的中枢神经系统。2000年，法国研究人员直接在蛋白质，其降解的辅助因子都具有1个结构上的人类胚胎上利用原位杂交技术检测到了仃、C3基共同特点，即它们除了拥有能与分子伴侣相结合因的表达谱。结果表明，该基因的表达在人类胚胎的结构域外．同时还具有1个与泛素一蛋白酶体发育过程中受到动态的调节。发育早期TTC3为降解相关的结构域，这一结构域或者是可以和蛋全身表达，发育晚期，该基因的表达则仅限于神经白酶体直接相互作用的片段(如H

5、SJ家族的蛋白)，系统_5]。但是关于其蛋白功能的研究在2009年之或者是具有泛素连接酶功能的结构域(如CHIP蛋前一直鲜有报道。2007年，意大利研究人员在研白)。CHIP蛋白不仅参与了错误折叠的蛋白质的究Citronkinase时发现TFC3蛋白可以与其相互降解。还参与了多种信号转导分子和凋亡相关分作用并抑制神经元的分化[6]。2009年末，由北海道子的降解过程，其作为一种具有E3泛素连接酶大学Dr．Noguchi在《Cdevelopment))上阐明了和共分子伴侣双重身份的蛋白，在机体的各个部Trc3的E3连

6、接酶活性。并报道了与细胞增殖、凋位均发挥着重要作用，其功能的异常将会引发包亡、肿瘤发生、糖类代谢密切相关的重要分子——括神经退行性疾病在内的多种疾病⋯。其特异性的泛素化底物Akt。与此同时，一些实验数据表明，在生物体内除近年来。分子伴侣和蛋白酶体在人类神经病CHIP外。还存在着具有类似双重蛋白身份的其他变中的作用机制不断被揭示。酵母双杂交结果提56生物学通报2014年第49卷第7期示C3可能是连接Hsp90和蛋白酶体之间的一为基因重组的载体，分别用酶切法构建pcDNA4一个桥梁(与CHIP类似)，是细胞内蛋白质质量

7、控myc一7TC3、pcDNA4一myc—venus一77'C3重组质粒，制系统的组成部分，TTC3基因表达异常可能会造设计2组实验。其中venus是GFP(绿色荧光蛋成其底物蛋白的泛素化水平和降解速率异常，或白)突变体，设计pcDNA4一myc—venus—TTC3，可利者导致细胞内蛋白酶活性异常。值得关注的是，用venus的荧光信号方便地检测蛋白表达情况。CHIP在人体的各个组织都有表达，而7TC3特异将pcDNA6／TR分别和重组质粒pcDNA4一myc—性表达于神经系统。中枢神经系统的蛋白错误折T-FC3／

8、pcDNA4一myC—venus一7TC3共同转染到细胞叠是否与唐氏综合征患者的一些表型(诸如智力内后，二者将有一定概率整合到细胞染色体DNA低下)相关，以及q3'C3是否也行使着与CHIP类上。可经抗生素筛选出稳定表达TTC3的单克隆似的功能，有较高的研究价值。细胞株(图2)。目前主要的研究手段仍然是通过瞬时转染外通过上述方法筛选出的细胞株中，TFC3基因