多重PCR法快速检测转基因玉米多种转化体技术优势的比较分析-论文.pdf

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1、江苏农业科学2014年第42卷第5期一57一李会，任志莹，王颖，等．多重PCR法快速检测转基因玉米多种转化体技术优势的比较分析[J]．江苏农业科学，2014，42(5)：57—59多重PCR法快速检测转基因玉米多种转化体技术优势的比较分析李会，任志莹，王颖，王建忠(辽宁省农业科学院开放实验室，辽宁沈阳110000)摘要：以常见的转基因玉米Bt176、MON810、MON863、NK603这4种转化体为检测对象，通过对其中MON810引物的重新设计和评价，建立并完善了转基因玉米四重转化体的PCR检测体系。结果表明，建立的四重PCR体系能有效检测出转基因玉米4种转化体，与单一PCR检测技术相比

2、，检测耗时缩短63％，成本降低75％，检测产生的废液减少75％，说明该方法具有简便、快速、低成本、低污染等优势，适用于转基因玉米多种转化的大规模系统性检测。·关键词：多重PCR；快速检测；转化体；技术优势中图分类号：TS201．1；S513．0l文献标志码：A文章编号：1002—1302(2014)05—0057—03玉米是我国重要的粮食作物和饲料来源，是全世界总产剂的使用，降低成本，也为其他作物品种转基因转化体的多重量最高的粮食作物。2013-2014年，由于玉米种植面积的增PCR检测方法的推广使用打下基础。加，中国玉米产量将会增加300万～400万t，玉米需求量增加1材料与方法800万

3、一1700万t，其中饲料用量增加600万一12O0万t。从当前来看，国内玉米生产增长的速度跟不上需求增长的速度，1．1试验材料为了满足需求，2013—2014年中国将进口6OO万～700万t玉转基因玉米Bt176、MONS10、MON863、NK603，购自艾吉米，并将储备量下调400万～500万t，而2012年中国的玉米析科技(北京)有限公司；非转基因玉米辽单565由辽宁省农进口量占全球玉米贸易的5％⋯，进口的主要为美国和巴西业科学院开放实验室保存。的转基因玉米。1．2使用试剂多重PCR(multiplexPCR)又称多重引物PCR或复合DNA提取试剂盒DP305购白天根生化科技有限公司

4、；PCR，它是在同一个PCR反应体系中加入2对及以上特异性Taq聚合酶、dNTPs、10×PCRbufer(含Mg“)、DI2000DNA引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域同时扩增Marker、6×LoadingBufer购自大连宝生物工程有限公司；其出多个目的片段的PCR技术，也是当前基因组检测方法的他试剂及耗材购自鼎国昌盛生物技术有限公司。一种。由于多重PCR试验设计较单一PCR要复杂得多，技1．3主要仪器术难度大，因而在建立多重PCR反应体系时，必须对其中的德国Eppendorf公司生产的5424型高速离心机；美国主要成分和反应条件进行繁琐的优化。。Thermo公司生产的N

5、ANODROP2000型DNA定量仪；C1000玉米转基因检测所采用的方法是针对通用元件进行检型梯度PCR仪、GelDoeXR+凝胶成像仪由美国Bio—Rad公测，其特异性较差，许多委托单位更趋向于特异性最高的转基司生产。因玉米转化体的检测。按照农业部有关标准或通告要求，目1．4试验方法前对转基因玉米Bt176、MON810、MON863、NK603等的转化1．4．1DNA提取采用试剂盒法，使用天根DP305试剂盒体检测方法均为单一PCR方法，通常采用的方法参考农业部提取转基因玉米4种转化体Bt176、MON810、MON863、NK603869号公告一8—2007、农业部869号公告一9

6、r2007、农业部及非转基因玉米的基因组DNA，经检测后，对DNA进行稀869号公告一10—2007、农业部869号公告一13—2007。本研释，使其浓度为25rig／，备用。究针对单一PCR方法成本高、所用时间长和检测产生的废液1．4．2引物设计各农业部公告中对应转基因玉米4种转多等弊端，利用转基因玉米的4种转化体作为研究材料，摸索化体的单一PCR引物设计见表1。针对多重PCR检测试验优化转基因玉米转化体的多重PCR体系和扩增条件，可以快的特点、原则和要求，对引物大小差未超过30bp的，借助软速准确地对样品进行检测，缩短检测时间，减少废液产生和试件进行重新设计，利用OligoV6．22对

7、设计引物进行评估，筛选出引物之间相互干扰最小的引物组合，保证PCR产物片段收稿日期：2014—01—1O大小在200bp以内时间隔大于3Obp。因此，针对MON810，基金项目：辽宁省科技攻关项目(编号：2011215O04)。利用Primer5．0软件进行引物设计并借助OligoV6．22软件作者简介：李会(1976一)，女，辽宁沈阳人，硕士，助理研究员，主要进行引物评价，具体的引物序列见表2，由大连宝生物工程有从事转