紫云英体细胞胚再生体系的建立-论文.pdf

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1、资源与环境科学现代农业科技2014年第2期紫云英体细胞胚再生体系的建立李一星石晓峰王建云李友国(华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，湖北武汉430070)摘要研究了外植体种类、植物激素以及水解酪蛋白(caseinhydrolysate，CH)浓度等因素对紫云英体细胞胚诱导及植株再生的影响，建立了紫-2r英体细胞胚的再生体系。结果表明：子叶柄在MS+4mg／L2，4一D+1000mg／LCH的培养基上，体细胞胚诱导率最高，达到58_3％：体细胞胚分化和植株再生培养基为I／2MS+0．1mg／LIBA+

2、0．5m玑6一BA+Ig／LCH，再生率达到6O．0％。研究结果为紫云英品种的选育及改良提供了新思路。关键词紫云英：体细胞胚：植株再生中图分类号Q253文献标识码A文章编号1007—5739(2014)02—0244—02紫云英又名红花草，主要分布于中国、韩国和日本等国叶柄置于添加不同浓度CH(0，500，1000，1500mg／L)的家，可以和根瘤菌共生固氮，是一种重要的水田绿肥，用于MS+4mg，L2，4-D培养基上诱导。20d后统计体胚诱导率，增加土壤肥力。除此之外，紫云英还是一种高产的、几乎与诱

3、导率(％)=具有体胚的外植体数／外植体总数xl00。紫花苜蓿相近的优良豆科牧草ll1，同时也可进行花蜜的生产1．2．3体细胞胚的成熟和植株再生。外植体在诱导培养基等。优良品种的选育是发展紫云英产业的基础[21，可通过转上培养20d后，将其转入添加不同激素组合的1／2MS+Ig／L基因或组织培养的方法培育优良品种。CH的培养基上生长。激素组合如下：①不同浓度2，4一D(0．1，体细胞胚发生途径是植物组织培养中器官发生的最有0．2mg／L)和KT(0．1，0．3，0．5mg／L)；②不同浓度IBA(0．1，

4、0．2效途径之一，同其他途径相比，体细胞胚具有结构稳定、再mg／L)~H6-BA(0．3，0．5，0．8，1．0mg／L)。培养30d届将子叶期生周期短、成苗率高和遗传稳定性好等优点_31，因此被广泛体细胞胚从外植体上取下计数，并将其转入无激素的1／2MS应用于植物育种和遗传转化等研究。目前在一些豆科植物培养基上萌发，每2周换1次新鲜培养基。3035d后计算如苜蓿14]、大豆【5l和三叶草同等品种中．已成功诱导出体细胞植株再生率，再生率(％)=小植株数目／体细胞胚总数(包括胚，并获得再生植株。在紫云英遗

5、传转化研究中，研究人正常胚和畸形胚)xl00。员已通过愈伤组织发生途径获得再生植株，但该方法周期1．2．4小植株的移栽和结瘤试验。将生长健壮并带有2～3片长，成苗率低川。该研究通过对多种因素的优化，建立了紫云真叶的小植株移入装有灭菌沙土的花盆中(沙土比为1：1)，英体细胞胚的直接再生体系。放入光照培养箱中培养3d后，接种华癸中慢生根瘤菌l材料与方法7653R，生长1个月后收获，观察结瘤情况。其间每2d用无1．1试验材料氮营养液浇灌1次。紫云英种子来自于河南信阳。所用植物激素为Duchfa1．2．5植物培

6、养条件。所有植株均置于光照培养箱中生长．公司产品，CH购自于武汉天源科技有限公司。华癸中慢生体细胞胚的诱导在黑暗条件下进行，体细胞胚的成熟和萌根瘤菌(Mesorh~obiumhuakuii)7653R由华中农业大学农业发、小植株的移栽及结瘤试验均在光照条件下进行。光照周微生物学国家重点实验室固氮室保存。期为16h光照，8h黑暗，温度分别为25、22℃。1．2试验方法2结果与分析1．2．1外植体的表面消毒。紫云英种子先用70％乙醇处理32．1外植体类型和植物激素对体细胞胚诱导的影响min，用2％次氯酸钠处

7、理20min，无菌水洗涤5-6次后，再以4日龄无菌苗的不同部位为外植体，培养20d后统放入无菌水中浸泡2h，最后置于含有0．5％蔗糖和1．2％琼计直接体细胞胚发生率(表1)发现：子叶柄较敏感，在柄的脂的培养基上萌发。萌发4d后，将子叶、下胚轴和子叶柄切口处可直接诱导出体细胞胚(图lA)；子叶和下胚轴没有(带有1／3子叶)从无菌苗上切下作为外植体．将每片子叶切直接体细胞胚的产生，但在2，4一D存在时可观察到愈伤组成2～3mm长的小段，下胚轴切成5mm长的小段。织的形成，其中少数愈伤组织可诱导出体细胞胚在所

8、用激1．2．2体细胞胚的诱导。所有培养基均含有0．8％的琼脂。为素中，2，4一D对体细胞胚诱导最有效，且浓度在2～8mg／L的了研究外植体种类及植物激素对体细胞胚诱导的影响。分诱导效果差别不大，取4mg／L为最佳诱导浓度。细胞分裂素别将不同外植体置于添加不同激素的MS+Ig／LCH培养基6-BA的使用对体细胞胚诱导不利。高浓度NAA(10mg／L)上诱导：①不同浓度2，4一D(0，2，4，6，8，10mg／L)；②4mg／L可直接诱导出少量