猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪流感病毒二重RT-PCR检测方法的建立-论文.pdf

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1、猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪流感病毒．．．．—●．．．．．—▲重RT-PCR检测方法的建立王洪光’，汤德元。曾智勇’。罗险峰，李春燕’，郝飞’，刘建’。李达’(1．贵州大学动物科学学院，贵州贵阳550025；2．贵州省动物疫病预防控制中心。贵州贵阳550008)摘要：为建立可同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)与猪流感病毒(SIV)二重RT-PCR方法，研究根据GenBank登录的相关病毒基因序列，选择保守区域设计引物。经过反应条件的优化，建立了可同时检测以上2种病毒的RT-PCR诊断方法，扩增的目的片段长度分别为364bp(PRRSV)和98

2、1bp(sly)。通过实验证明该方法具有良好的特异性和较高的敏感性，对PRRSV和SIV的核酸检测最低浓度分别为3．2X10ng和2．7X10～ng。应用该方法对32份临床样品进行检测发现，PRRSV阳性率为43．8％，SIV阳性率为31．3％，二重感染率为9．4％。该方法的成功建立为快速高效地检测以上2种病毒提供了有力手段。关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；猪流感病毒；二重RT-PCR随着现代养猪业规模化和集约化的表1扩增目的片段的引物发展，猪群发生多种病原混合感染和继■■■■墨墨矗弱曩雹蜀商曩发感染的情况越来越普遍，猪病的复杂PRRSV0RF636

3、4程度及其危害也与日俱增。目前，猪呼TTAAAGATGAGCCTTCTGACCGAGGSIv¨AGCGCTATGTTGACAAAATGACC吸道疾病是影响养猪业发展的主要疾病，也是我国规模化猪场的常发病、多行扩增，该方法不仅具有特异、快速、U1"31versalGenOm1cDNA&RNA发病，已经引起人们的普遍重视，给敏感、成本低等优点，更适用于大量临ExtractionKitVer．4．0购自大连宅我国养猪业带来极大的经济损失。在猪床样品的检测151。本研究拟建立一种能生物工程有限公司；E．Z．N．A．TM场常发生的各类病毒性呼吸道疾病中，够同时

4、并同步检测上述2种病原体单一GelExtractionKit(50)胶回收试剂盒PRRSV和SIV等是最为多见的病原⋯。或混合感染的RT-PCR方法，以对临系OMEGA公司产品；普通质粒小提PRRSV和SIV引起的猪呼吸道疾病主床病料进行快速、准确的诊断。试剂盒为TIANGEN公司产品；异丙要以发热、咳嗽、气喘、呼吸困难、眼1材料与方法醇、无水乙醇等为国产分析纯试剂。鼻分泌物增多、食欲减退、迅速消瘦等1．1病毒、细胞、质粒及菌株IcyclerThermalcycler型PCR仪为为特征；同时PRRSV还是引起妊娠母PRRSV系贵州省动物疫病研究室BI

5、O—RAD公司产品。猪发生流产，产死胎、木乃伊胎、无活鉴定并传代保存；SIV系华南农业大学1．3引物设计力弱仔、畸形胎，少仔和不育的猪繁惠赠；mark-145系中国兽医药品监察参照NCBI中PRRSVORF6殖障碍性疾病的主要病因之一1231。自所惠赠；pMD19-TVector购自大连宝(NC一00l961)、SIVM(GU086140)Mullis1983年建立PCR技术以来，该生物公司；大肠杆菌感受态ToplO由等基因序列，应用DNAStar、Oligo、方法不断得到发展，目前已成为当今动贵州省动物疫病研究室制备和保存。MPprimerandM

6、FEprimer设计多重物疫病检测和诊断中最具应用价值的方1．2主要试剂及仪器PCR引物，用于扩增目的基因片段【6】。法，该方法广泛应用于分子应用生物学MEM培养基、新生牛血清(NCS)引物序列详见表1。及其相关领域。mPCR是指在同一均系Hy-Clone公司产品；分子质量1．4病毒核酸提取PCR反应体系中使用多套引物，针对标准物DL2000Marker购自大连宝生分别将接毒细胞悬液及临床匀浆样多个核酸模板或同一模板的多个区域进物工程有限公司；TaKaRaMiniBEST品反复冻融3次后，各取200p-L，参照RNA&DNA提取试剂盒说明书，基金项目

7、：贵州省科学技术基金项目资助(黔科合J字【201312110号)；贵州省2011年农业攻关项目资助【鳊号：黔科合NY字(2011)5l05号】；贵州省2010年农业科技攻关项目【编号：黔科合NY字(2010)3042号1．按步骤提取病毒RNA，利用蛋白质核研农20l4015酸仪测定其浓度，-20℃保存备用。作者简介：王洪光(1989-)，女，硕士研究生，主要从事动物传染病病原分子病毒学的科研学习。·通讯作者：汤德元(1964-)，男，教授，博士，硕士生导师，主要从事动物传染病病原分子生物学和1．5RT-PCR反应中西兽医结合的教学科研工作。E—ITl

8、aiI：tdyua．n@l65．corn单一RNA病毒RT-PCR反应。98猪业科学SWINEINDUSTR