同时检测美洲型及欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒多重rt-pcr方法的建立与应用

《同时检测美洲型及欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒多重rt-pcr方法的建立与应用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、广西大学硕士学位论文同时检测美洲型及欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒多重RT--PCR方法的建立与应用姓名：赵日浪申请学位级别：硕士专业：临床兽医学指导教师：钟诚20120628同时检测美洲型及欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒多重RT-PCR方法的建立与应用’摘要为了建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的快速鉴别检测方法，本研究针对PRRSV的基因序列设计并合成3对特异性引物，分别为CO—ORF7、EU-ORF5和AM-Nsp2：利用CO．ORF7扩增美洲型和欧洲型毒株ORF7基因433bp／398bp片段；利用AM—Ns

2、p2扩增美洲型经典毒株和变异毒株Nsp2基因338bp／248bp片段；利用EU—ORF5扩增欧洲型毒株ORF5基因614bp片段。经过反应条件的优化，成功建立了能同时检测并区分美洲型经典毒株、高致病性变异毒株以及欧洲型毒株的多重RT-PCR检测方法。该方法可以特异扩增PRRSV对应的基因片段，而与猪瘟病毒(CSFV)、猪口蹄疫病毒(F加V)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV2)均无交叉反应；对重组质粒标准品的检出下限为1．67×103拷贝／此；在相同条件下进行的重复试验可获得均匀

3、一致的结果。应用检测PRRSV的多重RT-PCR方法对临床采集的176份疑似病料进行检测，结果PRRSV阳性45份，其中美洲型变异毒株41份、经典毒株4份，未检测到欧洲型毒株。针对临床上PRRSV和CSFV混合感染时有发生的情况，为建立能同时检测CSFV和PRRSV的方法，针对CSFV和PRRSV的基因序列设计3对特异性引物，即CSF-NS2、AM-Nsp2、EU-ORF5。其中，CSF-NS2扩增CSF毒株NS2基因508bp片段，AM-Nsp2扩增PRRS美洲型经典毒株和变异毒株Nsp2基因338bp／248bp片

4、段，EU-ORF5扩增PRRS欧洲型毒株ORF5基因614bp片段。经过反应条件的优化，建立了能同时检测并区分CSF毒株和PRRS美洲型经典毒株、变异毒株及欧洲型毒株的多重RT-PCR方法。该方法可以特异扩增CSFV和PRRSV，而与FMDV、PRV、PPV、PCV2均无交叉反应；对CSFV和PRRSV4种重组质粒标准品的检出下限均为1．67x103拷贝／止。应用该方法对采集的106份临床疑似病料进行检测，结果CSFV和PRRSV变异株混合阳性4份，占3．77％(4／106)；CSFV阳性7份，占6．60％(7／106

5、)；PRRSV变异株阳性17份，占16．04％(17／106)。本研究成功建立了的两种检测PRRSV的多重RT-PCR方法，一是同时检测美洲型及欧洲型PRRSV的多重RT-PCR方法，二是同时检测CSFV及美洲型、欧洲型PRRSV的多重RT-PCR方法，为PRRSV和CSFV的临床快速鉴别检测和流行病学调查提供了有效的技术平台。关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；美洲型毒株；欧洲型毒株；猪瘟病毒；多重RT-PCR；检测方法EstablishmentandapplicationofamultiplexRT-PCRassayf

6、orsimultaneousdetectionoftheNorthAmericangenotypeandtheEuropeangenotypeofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)ABSTRACTAbstract：InordertoestablishoneassaytosimultaneousanddifferentialdetectionoftheNorthAmerican(NA)genotypeandtheEuropean(E∽genotype

7、ofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)，threepairsofspecificprimersweredesigned．neywerenamedasCO—ORF7，EU-ORF5andAM-Nsp2，respectively,ofwhichCO—ORF7specificallyamplified433bp／398bpORF7genefragmentoftheNAgenotypeandtheEUgenotype，AM-Nsp2specifically

8、amplified338bpor248bpNsp2genefragmentoftheclassicalstrainorthehighlypathogenic(uP)variantoftheNAgenotype，andEU—ORF5specificallyamplified614bpORF5genefragmentoftheEUge