GBT27521-2011-猪流感病毒核酸RT-PCR检测方法.pdf

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1、ICS11．220B41a雷中华人民共和国国家标准GB／T27521—2011猪流感病毒核酸RT-PCR检测方法RT-PCRassayforswineinfluenzavirusnucleicacid2011-11-21发布2012-03-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局学右中国国家标准化管理委员会厘111标准分享网www.bzfxw.com免费下载目q蟊GB／T27521--2011本标准按照GB／T1．12009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物

2、防疫标准化技术委员会(sAC／TC181)归口。本标准起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，中国检验检疫科学研究院，中国兽医药品监察所。本标准主要起草人：乔传玲、韩雪清、杨焕良、刘业兵、陈艳、吴绍强、陈化兰、林祥梅、辛晓光、朱中武、王慧煜、刘建、李建、梅琳、王伊琴、徐彪、阮周曦、宁宜宝、薄清如、秦智锋、林志雄。标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围猪流感病毒核酸RT-PCR检测方法GI／T27521—2011本标准规定了猪流感病毒核酸RT-PCR检测方法的技术要求。本标准规定的R

3、T·PCR检测方法适用于检测猪肺脏组织、鼻腔及气管分泌物和这些采集样品培养物中的猪流感病毒核酸。2缩略语下列缩略语适用于本文件。DEPC：焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate)dNTP：脱氧核苷酸三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate)EB：溴化乙锭(ethidiumbromide)M_MLVRT：莫洛尼氏鼠白血病病毒反转录酶(moloneymurineleukemiavirusreversetran．-scriptase)PCR：聚合酶链式反应

4、(polymerasechainreaction)RNA：核糖核酸(ribonucleicacid)RNAaseinhibitor：RNA酶抑制剂RT-PCR：反转录一聚合酶链式反应(reverse_transcriptionpolymerasechainreaction)SPF：无特定病原体(specificpathogenfree)ngDNApolymerase：TnqDNA聚合酶3仪器3．1PcR仪。3．2台式低温高速离心机。3．3电泳仪。3．4电泳槽。3．5冰箱。3．6凝胶成像系统。3．

5、7微量移液器。3．8水浴锅。4试剂4．1LSTRIzolRNA提取试剂或其他商品化的RNA提取试剂。4．2氯仿、异丙醇、无水乙醇。4．31．2％琼脂糖凝胶，见附录A中A．1。4．450×TAE缓冲液，见附录A中A．2。标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27521--20114．5溴化乙锭(EB，10pg／pL)或核酸染料，见附录A中A．3。4．6焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的灭菌双蒸水，见附录A中A．4。4．7DNA分子量标准(100bp)。4．8M-MLV反转录酶。4．9RN

6、A酶抑制剂。4．10TaqDNA聚合酶。4．11dNTP。4．12商品化的一步法RT—PCR反应试剂。含有RT-PCR缓冲液，酶混合物，dNTP混合物，无RNA酶的水等。5引物5．1反转录引物见附录B中B．1。引物浓度为20pmol／pL。5．2PCR引物见附录B中B．2。引物浓度均为20pmol／pL。6样品对照以灭活的猪流感病毒感染SPF鸡胚尿囊液或者感染动物的组织作为阳性对照，以正常SPF鸡胚尿囊液或者正常动物组织作为阴性对照。7操作步骤7．1样品的采集及处理7．1．1采样工具下列采样工具

7、应经121℃士2℃，15rain高压灭菌并烘干；a)棉拭子；b)剪刀；c)镊子；d)1．5mL离心管；e)研钵。7．1．2活猪取鼻拭子。采集方法如下：将棉拭子深入鼻腔旋转，取鼻腔分泌液；将采样后的拭子分别放入盛有1．0mLPBS(见附录A中A．5)的1．5mL离心管中，加盖、编号。7．1．3病死猪取肺脏或气管分泌物等。采集方法如下：用无菌镊子和剪刀采集肺脏等，装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号。7．1．4样品贮运样品采集后，放人密闭的塑料袋内(一个采样点的样品放一个塑料袋)，于保温箱中加冰、密

8、封，24h内送实验室。2标准分享网www.bzfxw.com免费下载CB／T27521—20117．1．5样品处理7．1．5．1棉拭子处理方法样品在混合器上充分混合后，用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出，弃去拭子，室温静置30min，4℃、3000r／rain离心15min，取上清液转入无菌的1．5mL离心管中，编号备用。7．1．5．2脏器处理方法将所采组织病料置于洁净、灭菌并烘干的研磨器中，按质量体积比(1：1)加入样品保存液进行充分研磨；4℃、3000r／min离心15min，取上清液转入无菌