Beclin-1表达对舌癌细胞 Tca8113顺铂敏感性的影响-论文.pdf

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1、山东医药2014年第54卷第31期128—135．[16]LeeMY，ShimMS，KimBH，ela1．Effectsofspironolaetoneandlosartan013diabeticnephropathyinatype2diabeticratmodel[J]．DiabetesMetabJ，20l1，35(2)：130—137．A～．-Ⅲ邑m∞二霎m2e(收稿13期：2014-05—16)¨抵一li：苎Ⅲm_一Beclin一1表达对舌癌细胞Tca8113顺-．墓一薹．铂眦一～敏舱㈨呲感

2、一¨№性的影响陈伟泉，谭广谋，黄文喜，黄海燕(广州医科大学附属肿瘤医院，广州510095)O印cnCa●摘要：目的观察自噬基因Beclin1表达对舌癌细胞Tca8113顺铂敏感性的影响。方法分别构建过表达和干扰Beclin一1的真核表达载体，并建立稳定表达和稳定干扰Beclin一1的Tca8113细胞模型，RT—PCR和Westernblotting法检测Beclin一1表达，M3T法检测上述细胞模型对顺铂的敏感性。结果成功建立稳定表达Beclin一1的细胞模型Tca8113／pLEX—Becli

3、n一1，其与对照细胞系对顺铂的半数抑制浓度(IC)分别为(11．99±0．34)、(5．03±0．16)mg／L，P<0．01；成功建立干扰Beclin一1表达的细胞模型Tca8113／pRNAT—Beclin一1一sh1，其与对照细胞系对顺铂的Ic分别为(2．76±0．09)、(5．01±0．18)mg／L，P<0．01。结论下调Beclin一1表达可增加舌癌细胞Tca8113删顷铂的敏感I生。关键词：舌癌；Beclin一1基因；顺铂；药物疗法；化学疗法doi：10．3969／j．issn．10

4、02—266X．2014．31．O11中图分类号：R739．86文献标志码：A文章编号：1002—266X(2014)31-0034—03舌癌是一种较为常见的口腔颌面部恶性肿瘤，白酶抑制剂购自Fermentas公司。BCA蛋白浓度测定目前治疗以手术(原发灶切除及颈部淋巴结清扫试剂盒购自Pierce公司，Beclin一1抗体、辣根过氧化物术)为主，围术期辅以放化疗，但化疗耐药的出现严酶偶联的羊抗兔IgG购自SantaCruz公司；ECL化学发重制约了舌癌的临床治疗。细胞在营养剥夺或其他光试剂盒购自M

5、illipore公司；引物及干扰片段均由In—细胞应激的刺激下可迅速产生大量自噬溶酶体，引vitrogen公司合成，其余试剂购自广州威佳生物有限公发自噬潮、帮助细胞缓解应激或促进细胞凋亡J。司。Beclin一1是参与哺乳动物自噬体形成的关键因1．2过表达和干扰Beclin一1真核载体的构建在子J，而自噬在肿瘤的发生、发展、远端转移及化疗NCBI上获得Beclin一1(NM一003766．3)的序列，使用耐受中发挥重要作用。本研究观察了Beclin一1PP5软件设计Beclin．1过表达的引物(名称

6、及序列表达对舌癌细胞Tca8113顺铂敏感性的影响，以期略)，以Tca8113细胞cDNA为模板，PCR扩增得到为舌癌的临床治疗提供理论依据。Beclin．1片段。程序如下：942min，9810S，1材料与方法68℃1min，35个循环；72℃2min。琼脂糖凝胶1．1材料舌癌Tca8113细胞购自中国科学院上海回收目的片段，并将其与真核表达载体pLEX—MCS细胞库，接种于含10％新生牛血清的RPMI1640培养基分别用限制性内切酶BamHI和MluI于37cC酶切中，置于37℃、5％CO：的

7、培养箱中培养，至对数生长期3h；琼脂糖凝胶检测酶切效果，回收酶切载体和后用于实验；培养基RPMI1640、胰酶和新生牛血清购自DNA片段，T4DNAligase连接该DNA片段和载体，Gibco公司，逆转录试剂盒购自TaKaRa公司，四唑化合转化大肠杆菌感受态DH5cx，挑取单克隆送Invitro．物(MTS)购自Promega公司，顺铂、嘌呤霉素、氨基糖苷gen公司测序，鉴定阳性克隆。利用在线软件Block—类抗生素G418购自Sigma公司，凝胶抽提试剂盒、无iTFMRNAiDesigner设

8、计Beclin一1的shRNA序列。内毒素质粒抽提试剂盒I购自广州飞扬生物有限公司，在Invitrogen公司合成该干扰片段，95℃5rain退火BamHI、MluI和Hindm限制性内切酶、蛋白裂解液、蛋(体系包括5XPCRBuffer10，上游shRNA序列34⋯尔医药2014印第54卷第3l期20L，下游shRNAJ歹020IxL)；BamHI和Hindm成功构建过表达Beelin—l的真核载体pLEX—Bee．脯载体pRNAT—U6．1／neo，T4DNAligase连接退