DDP细胞顺铂敏感性的研究-论文.pdf

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1、实用肿瘤杂志2012年第27卷第6期·583·MicroRNA-181a提高A549／DDP细胞顺铂敏感性的研究冯春来，王智刚，李皓(1．常州市第一人民医院呼吸科，江苏常州213003；2．江苏大学附属人民医院中心实验室，江苏镇江212001)摘要：目的观察miR一181a对A549／DDP细胞顺铂敏感性的影响，并探讨其机制。方法采用miR一181anllmic转染A549／DDP细胞，MTT法检测细胞增长率；荧光定量PCR检测A549／DDPmiR一181a表达；免疫印迹法检测Bcl一2蛋白表达；AnnexinV／PI双标

2、法检测细胞凋亡。结果miR一181a提高A549／DDP细胞的顺铂敏感性，促进顺铂诱导的细胞凋亡，并且降低Bcl一2蛋白的表达。结论miR一181a通过降低Bcl一2蛋白表达，促进顺铂诱导的细胞凋亡，从而提高A549／DDP细胞顺铂敏感性。关键词：肺肿瘤；微RNAs；腺癌；顺铂／药理学；转染；细胞凋亡中图分类号：R734．2文献标志码：A文章编号：1001．1692(2012)06~583—04肺癌是恶性肿瘤中的常见病和多发病，且发病CUCCGAACGUGUCACGUTT)购自GenePharlTla公司。率呈日渐上升趋势，

3、而治疗效果却不令人满意¨J。取对数生长期细胞进行细胞转染，按Lipofectamine化疗是肺癌治疗的主要手段，但肿瘤对化疗药物产2000说明书的方法将miR．181a和阴性对照分别转染生耐药常常导致化疗失败，也是复发、转移的主要到A549／DDP细胞中。取对数生长期细胞接种于6原因。因此，克服和干预肿瘤细胞耐药是临床亟孑L板，每孔1．0X10个细胞，细胞生长至占培养孑L待解决的问题。有研究发现microRNA-181a(miR一80％～85％时进行转染。首先弃去旧培养液，用PBS181a)是一种肿瘤抑制因子，与肿瘤耐药有关

4、。本实液洗涤细胞1次。制备miRNA／Lipofectamine2000复验旨在研究miR一181a对A549／DDP细胞顺铂敏感合物，6孑L培养板每孑L试剂用量如下：稀释10性的影响，并且探讨其机制，以期为肺癌耐药的治疗Lipofectamine2000至100l无血清培养液OPTI—提供新的方法。MEM中，充分混匀，室温放置5分钟；同时用100I,zL无血清培养液OPTI—MEM稀释4g质粒载体，充分1材料与方法混匀，室温放置5分钟；将两种混合物轻轻混合均匀，1．1细胞和细胞培养A549和A549／DDP细胞株室温放置2

5、0分钟即得到miRNA／Lipofectamine2000由江苏大学附属人民医院中心实验室保存。两种细复合物。将miRNA／Lipofectamine2000复合物轻滴胞均常规培养于含10％胎牛血清的RPMI一1640完人到6孔培养板孔中，轻晃6孔板将复合物摇匀。全培养液中，含100kU／L青霉素、链霉素，置于37~C培养箱培育l8—24小时后，每孔加1800L含37~C、5％CO，的饱和湿度的培养箱中培养，2—3天10％胎牛血清的RPMI．1640培养液培养细胞。转染换液1次。0．25％胰酶消化传代。48小时后，倒置荧光显

6、微镜观察转染率，转染率约1．2研究方法75％，取细胞进行实验。1．2．1microRNA转染miR一181amimie(AACAU1．2．2荧光定量PCR方法检测miR-181a表达UCAACGCUGUCGGUGASGU)和阴性对照(NC)(UUmiR．181a的检测和定量采用GenePharma公司的Harpin．itmiRNA一181aqPCRQuantitationKit进行，茎环反转录引物和定量引物由此试剂盒提供，操作收稿日期：2012—02—18步骤按照此试剂盒进行。简要如下：采用trizol法提基金项目：常州市青

7、年医学创新人才计划(常卫科教取细胞内的总RNA，1gRNA进行反转录。反转『2010]368号)作者简介：冯春来(1976一)，女，江苏常州人，常州市第一录体系如下(40L)：5XRTbuffer8L，dNTP(10人民医院副主任医师，硕士，从事肺癌的基础与临床研究．txmol／L)1．5L，U6Primer(10~zmo]／L)2．4L，通信作者E—mail：yykjk80814@qq．COnlmiR．181aPrimer(10~mol／L)2．4L，RNasin(400·584·JournaIofPracticalOnc

8、oloRyVo1．27No．62012U／p．L)0．5L，反转录酶MMLV(200U／p~L)0．4每次l0分钟，加入ECL发光试剂，摄影。Westernp．L，RNA1P．g，ddH2O至40L。反转录条件：blot图像结果扫描存人计算机，用QuantityOne图像16℃，30分钟；