原代培养乳鼠窦房结细胞的形态学及表面抗原研究.doc

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1、原代培养乳鼠窦房结细胞的形态学及表面抗原研究作者：管思彬，马爱群，蒋文慧【摘要】目的建立乳鼠窦房结细胞(SNC)的体外分离纯化培养方法，了解SNC的形态结构特点，观察表面抗原超极化激活环核昔酸门控阳离子通道基因4(HCN4)和缝隙连接蛋白45(Cx45)的细胞表达特点，为细胞牛物起搏的深入研究提供…定实验依据。方法取新生SD乳鼠的窦房结组织，胰酶逐次消化，并予差速贴壁及5漠脱氧尿卩密噪核昔(5BrdU)纯化处理进行原代窦房结细胞的培养。结杲在培养的窦房结细胞中可观察到3种形态的细胞，即梭形细胞、三角形细胞和

2、多边形细胞，其中梭形细胞所占比例最大，搏动频率最快，细胞器不发达，肌原纤维稀少，表达HCN4和Cx45；三角形细胞微量表达Cx45o结论①胰酶消化法结合差速贴壁及5BrdU处理，是可靠的窦房结细胞纯化培养技术；②搏动频率最快、HCN4和Cx45表达阳性的梭形细胞可能系窦房结起搏细胞。【关键词】窦房结细胞细胞培养HCN4ABSTRACT:ObjectiveTounderstandmorphologicalcharacteristicsofsinoatrialnodecells(SNCs)bytakingpur

3、ifiedisolationandcultureofneonatalratsSNCsinvitroandtounderstandtheexpressioncharacteristicsofsurfaceantigenshyperpolarizationactivatedcyclicnucleotidegatedcationchannel4(HCN4)andconnexin45(Cx45)onSNCs.MethodsTheSNCswereisolatedfromsinusnodetissuesremovedf

4、romneonatalratsbytrypsinandpurifiedculturedwithdifferent!alattachmentand5bromodeoxyuridine(BrdU)treatment・ResultsThreedifferenttypesofcelIswereobservedamongthepurifiedculturedSNCs:spindle,triangularandirregularcells.Thespindlecellstookupthegreatestproporti

5、on,hadthefastestbeats,andhad1essdevelopedorganel1eandscarcemuscularfibrils・ImmunofluorescencestainingwaspositiveagainstHCN4andCx45onthespindlecells.SmallamountsofHCN4wasobservedontriangularcells・Conclusion①Isolationbytrypsincombinedwithdifferentialattachme

6、ntandBrdUtreatmentisareliableapproachtoculturingsinoatrialnodecells.②Thespindlecellswiththefastestbeatsandpositiveexpress!onsofHCN4andCx45maybethesinusnodepacemakercells.KEYWORDS:sinoatrialnodecel1:cel1culture;HCN4心脏生物起搏已成为治疗窦房结病变所致缓慢型心律失常中的研究热点，其中关键是改善、恢复

7、窦房结功能甚至重建窦房结。因而，了解窦房结细胞特别是窦房结起搏细胞的形态、抗原表达及功能特点可以更好的对其进行修复与替代。近年来关于窦房结细胞的培养已有若干报道[13],但细胞表面抗原的研究较少，故本研究通过对原代培养的乳鼠窦房结细胞进行形态学及表面抗原观察，旨在更好的了解窦房结细胞的特性，以期为牛物起搏的研究提供…定实验依据。1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物出生24〜36hSD乳鼠，雌雄不限，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。4周龄SD雌性大鼠，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。1.1.2

8、仪器与试剂SZ61型解剖显微镜、CK40型倒置生物显微镜、BX51型荧光生物显微镜（均为Olympus公司）、胰蛋口酶（Amresco公司）、胎牛血清（Hyclone公司）、DMEM高糖培养基（GTBCO公司）、5漠脱氧尿卩密喘核廿（5BrdU,Sigma公司）、正常山羊血清（武汉博士徳公司）、兔抗大鼠HCN4多克隆抗体（Alomone公司）、小鼠抗大鼠Cx45单克隆抗体（Chemicon公司）、山羊抗小鼠IgG