原代成骨细胞、成纤维细胞培养SOP.doc

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1、原代成骨细胞、成纤维细胞培养SOP01SOP原代成骨细胞、成纤维细胞培养1.和仪器，技术相关的危害物质?无2.准备工作仪器和耗材：?TDGC2J超净工作台（苏州净化设备厂）?AUTOCLAVEMLS-3780高压灭菌锅（SANYO）?DGG-9140B型电热烘干箱（上海森信实验仪器有限公司）？DK-8D型水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）？SZ・93纯水蒸憾器（上海亚荣生化仪器厂）7C0ICXDS-1B倒置显微镜?MC0-15ACC02INCUBATOR（细胞培养箱，日本Sanyo）?移液器（Gilson公司）?废液缸?10P1,200P1,100

2、0PI无菌枪头?…次性无菌吸头?4°C冰箱（海尔）?细胞培养瓶（25cm2）?手术器材（高压灭菌）?培养皿试剂：?DMEM（无血清）?无菌水?含胎牛血清20%的DMEM?lxPBS?胶原酶I1.操作者防护措施?实验服?手套?注意面部防护2.工作区域?超净工作台3.流程准备工作：操作步骤：1.将患者组织用提前用火烧过蹑子夹到培养皿中。2.用SmIPBS冲洗2次。01StandardOperatingProcedure校对日版本号：VI创建日期：9/3/2011创建者：杨小萌期:校对者:Page1of201SOP1.另取两个培养皿分别标记患者姓名，编号

3、，SK或B0,并分别加入5mlDMEM（lXPBS）o2.将各组织（肌肉，骨）按标好的分别放到各培养1U1中。3.用火烧过的剪刀跟锻子分别剪碎皮肤跟骨，各加入80微升胶原酶I。混均，于37°C,5%CO2孵箱中培养，3小时。4.取两个15ml离心管，标记SK’BO,培养瓶标记01■姓名-SK/B0-1.5.吸取培养皿中培养液于孔筛中过滤到15ml离心管中，1500r/10min离心。6.吸上清培养液于培养皿中，37°C继续培养（每隔3小时收集一次细胞）。7.加lml带血清的DMEM于离心管中，重悬细胞，转移到小培养瓶中。8.再于培养瓶中加4mlDM

4、EM（带血清）,37°C,5%CO2孵箱中培养。9.每隔3小时重复一次，共3次。10.培养瓶中的细胞每3天换一次液（换液前用PBS冲洗两遍）。清洁流程?75%乙醇擦拭超净工作台?紫外照射30分钟1.废物、废液处理?84消毒液清洗废液缸，废弃物集屮处理01StandardOperatingProcedure校对口版本号：VI创建口期：9/3/2011创建者：杨小萌期：校对者:Page2of2