大豆胰蛋白酶抑制剂和脂肪氧化酶基因双价RNAi表达载体的改造及转化-论文.pdf

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1、第4O卷第12期西北农林科技大学学报(自然科学版)Vo1．40No．122012年12月JournalofNorthwestA&FUniversity(Nat．Sci．Ed．)Dec．2O12网络出版时间：2012—11-1916：46网络出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／61．1390．S．20121119．1646．022．html大豆胰蛋白酶抑制剂和脂肪氧化酶基因双价RNAi表达载体的改造及转化王丹，付永平，王丕武，马建(吉林农业大学生物技术中心，吉林长春130118)[摘要]【目的】应用RNA干扰技术同时抑制

2、大豆脂肪氧化酶(Lox)和胰蛋白酶抑制剂(KTi)基因的表达，改良大豆品质，培育缺失Lox和KTi的大豆新材料。【方法】应用RNAi原理，以双价RNAi植物表达载体pCAM—BIA1301一KtiRi—LoxRi为基础，以植物表达载体pCAMBIA3301的质粒DNA为模板，利用CaMV35S启动子的上游引物和CaMV35S终止子的下游引物，PCR扩增含有除草剂抗性基因bar的整个表达原件，然后将其插人到pCAM—BIA1301一KtiRi—LoxRi中，构建以除草剂为筛选标记的双价RNAi表达载体，并通过花粉管通道法转化至大豆吉农18、吉农28和吉农27

3、3个品种中，对转基因植株进行PCR、Southern杂交、RT—PCR分子水平检测和除草剂抗性检测。【结果】质粒PCR和酶切鉴定以及测序结果表明，双价RNAi植物表达载体pCAMBIA1301一KtiRi—LoxRi—bar构建成功。将其转入到大豆中，分别获得吉农18、吉农28、吉农27T代籽粒47，25和86粒，以及Tz代转基因植株5o株。RT—PCR结果表明，转基因株系中脂肪氧化酶和胰蛋白酶抑制剂mRNA积累受到明显抑制。【结论】获得了转pCAMBIA1301一KtiRi—LoxRi—bar的T2代转基因大豆。[关键词]大豆；胰蛋白酶抑制剂；脂肪氧化酶

4、；花粉管通道法；除草剂[中图分类号]$565．103．53[文献标志码]A[文章编号]1671—9387(2012)12—008505ConstructionandtransformationofRNAiplantexpressionvectoroflipoxygenaseandkunitztripsininhibitorgenesfrOmsoybeanWANGDan，FUYong—ping，WANGPi—wu，MAJian(CollegeofAgronomy，JilinAgriculturalUniversity，Changchun，Jilin13011

5、8，China)Abstract：[Objective]TheobjectiveofthisstudywastofindanewbreedingtechniqueofsoybeantoimproveitsqualityandcreatenewelitegermplasmresourceofsoybeanbyRNAi，whichprohibitedtheex—pressionoflipoxygenaseandkunitztripsininhibitorgenesinsoybeanseed．[Method]Inthisresearch，weusedplante

6、xpressionvectorpCAMBIA1301·-KtiRi—LoxRiassubstrateandusedpCAMBIA3301asthetem——plate．CaMV35SpromoterwasupstreamprimerandCaMV35sterminatorwasdownstreamprimer．ThewholeexpressionobjectivewithherbicideresistancegenewasamplifiedbyPCRbeforebeinginsertedintopCAMBIA1301一KtiRi—LoxRitoconstr

7、ucttheRNAiexpressionvectorusingherbicideasselectionmarker．ThentheobtainedexpressionvectorwastransferredtosoybeancultivarsJinong18，Jinong28andJinong27bypollentubepathwayTransgenicplantswerescreenedwithbarstar，anddetectedbyPCR，Southernblot，andRT-PCR．[Result]Wehaveobtainedseed—specif

8、icexpressionvectorpCAMBIA1301一Kti