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1、2006年第2期211反相高效液相色谱定量分析多肽中的氨基酸组成吕艳,冯凤琴(浙江大学生物工程与食品科学学院,浙江杭州310029)摘要:采用异硫氰酸苯酯柱前衍生、反相高效液相色谱、外标法定量的方法分析多肽中18种氨基酸组成。对常用2种衍生化方法进行比较,结果表明其中一种,衍生步骤简单,但有3种氨基酸不能检出;另一种衍生步骤繁琐,但18种氨基酸都能检出,并且分离效果很好。关键词:反相高效液相色谱;氨基酸;异硫氰酸苯酯;多肽;比较中图分类号:TS2文献标识码:A文章编号:052829017(2006)0220211203氨基酸的组成分析是多肽(蛋白
2、质)化学研究苯基硫酸盐2氨基酸稳定性非常好。该方法是目前中最基本的内容之一。通过氨基酸组成分析可以初氨基酸分析中具有吸引力的分析方法之一。本文就步了解多肽(蛋白质)的化学结构特点,以及某些选用异硫氰酸苯酯柱前衍生反相高效液相色谱法分特征活性氨基酸的分布情况,对多肽(蛋白质)结析测定多肽中氨基酸的组成,并对两种衍生化方法构与功能的研究提供科学的信息。多肽(蛋白质)进行了比较。中氨基酸的组成分析方法分为三个步骤:(1)首先1材料、试剂与设备将多肽水解成游离的氨基酸;(2)然后将游离氨基酸衍生;(3)分离和定量测定氨基酸衍生物。主要试剂:氨基酸标准品(
3、BDHChemicalsLtd多肽水解成游离氨基酸常用的经典方法是:在PooleEngland)、乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)、6molPLHCl介质中,110e水解24h。丁雅韵等在苯异硫氰酸酯(化学纯)、三乙胺(分析纯)、醋酸两种通常可以使蛋白质完全水解的实验条件钠(分析纯)、磷酸氢二钠(分析纯)、无水乙醇(6molPLHCl,110e水解24h和150e水解115h)(分析纯)、正己烷(分析纯)下对氨基酸混合溶液分别进行了几次平行模拟水解主要仪器:Waters2695高效液相色谱仪、实验,结果表明,绝大多数氨基酸在两种水解条件Waters
4、2996二极管阵列检测器、反相C18柱、真空下都很稳定,结果的平行性也很好。本文选用干燥器、ZKB299型循环水多用真空泵、安瓿管、150e水解115h。万分之一电子天平、KQ2250B型超声波清洗器、数氨基酸含量检测主要应用氨基酸自动分析仪和显电热鼓风干燥箱高效液相色谱(HPLC)。随着HPLC的发展,使用2试验方法HPLC技术分析氨基酸获得迅速发展,由于HPLC技术无需特殊反应装置,具有高效、简便、快速、211多肽水解成游离的氨基酸准确和价格低廉等优点,已在许多实验室部分或全准确称取10mg的蛋白质样品于安瓿管中,加部代替了氨基酸自动分析仪,
5、广泛应用于多种生物入6molPLHCl溶液10ml后真空烧结封口,移入样品内氨基酸的检测。150e恒温箱中加热115h,取出冷却。用微量注射HPLC测定氨基酸的方法也很多,反相高效液器吸取20Ll水解液于115ml离心管中,真空干燥相色谱(RP2HPLC)检测氨基酸的柱前衍生试剂就备用。有近10种。在异硫氰酸苯酯(PITC)和氨基酸的212氨基酸的衍生化反应反应产物苯基硫酸盐2氨基酸的稳定性被证明后,根据文献报道,采用苯异硫氰酸酯对氨基酸进PITC才直接用于氨基酸分析。这种方法的优点是行衍生的方法主要有两种,本文对这两种方案进行PITC与氨基酸和
6、亚氨基酸均能反应,且衍生产物比较。收稿日期:2005_05_11作者简介:吕艳(1981-),女,山东威海人,硕士研究生,研究方向为生物活性肽的研究与开发。2122006年第2期(1)方案一。取氨基酸标准储备液(18种氨表1流动相梯度洗脱表基酸的质量浓度均为2718mgPL,011molPL的HCl时间(min)流速(mlPmin)A(%)B(%)定容)或样品溶液200Ll置于2ml离心管中,加01101000入011mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液100Ll、131109372311077231molPL三乙胺乙腈溶液100Ll,混匀,室温下放置
7、2911065351h后加入400Ll正己烷,游涡混合器振荡1min,351106040静置10min。用注射器吸取下层溶液,经0145Lm401100100滤膜过滤后进样进行色谱分析。451100100471101000(2)方案二。501101000溶液配制。再干燥液:乙醇B水B三乙胺=2B2B1(VPV);酸3种氨基酸不出峰。可能是因为这3种氨基酸为衍生溶液:异硫氰酸苯酯B乙醇B三乙胺B水=亲水性较强的氨基酸,而PITC为淡黄色油状液体,1B7B1B1(VPV)。与水不能互溶,致使这3种氨基酸在该衍生体系下样品稀释液:取354mgNa2HP
8、O4#12H2O加200无法被PITC衍生。因此如果只需要测定除天冬氨ml蒸馏水溶解,用磷酸2乙腈(95/5)溶液调至pH酸、谷氨酸和半
