结肠癌组织IL―10和IFN―γ mRNA的表达及其临床意义.doc

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1、结肠癌组织IL-10和IFN—ymRNA的表达及其临床音义【摘要】目的：研究结肠癌组织白细胞介素TO（儿-10）和干扰素-Y（IFN-Y）的基因表达及其相关的启动子区甲基化状态。方法：随机选取2011年1月-2014年6月80例结肠癌患者组织为结肠癌组、80例相应癌旁组织为癌旁组和100例正常健康者结肠组织为対照组。采用亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性PCR和实时荧光定量PCR检测对IL-10和IFN-Y基因的甲基化状况进行检测，分析其与结肠癌主耍临床特征之间的关系。结果：三组组织的IL-10和IFN-yinRNA水平之间比较，差异均有统计学意义（P癌旁组〉对照组，差异均有统计学意义（P<

2、0.05）o结论：IL-10和TFN-Y基因启动子区甲基化状态影响具在结肠癌组织中的表达，结肠癌患者处于TH2极化状态，与结肠癌发生发展密切相关。【关键词】结肠肿瘤；DNA甲基化；组织；干扰素-y；白细胞介索-10结肠癌患者机体内免疫微环境的变化己经受到人们的重视，其中辅助性T细胞（Th）亚群Thl/Th2的失衡在恶性肿瘤免疫逃逸与免疫耐受屮非常重耍［1］。在哺乳动物细胞基因组中，约有3%〜5%的胞“密唏被甲基化，基因甲基化异常与结肠癌变化密切相关［2］,因此制定结肠癌Thl、Th2相关细胞因子DNA甲基化谱对结肠癌的早期诊断有重要意义。本文通过检测结肠癌患者结肠组织中Thl/Th2型细

3、胞因子白细胞介素-10（TL-10）和干扰素-丫（IFN-y）基因启动子区甲基化状态及转录活性，旨在探讨DNA甲基化与基因表达的关系及其在结肠癌中的作用，为结肠癌的诊断和治疗提供新的靶点。1资料与方法1.1一般资料随机选取2011年1月-2014年6月本院住院部就诊的80例结肠癌患者组织为结肠癌组、80例相应癌旁组织为癌旁组和100例正常结肠组织为对照组。结肠癌患者年龄34〜75岁，中位年龄49岁，男55例，女25例，病理类型均为鳞癌，根据WHO标准分级[3],高分化鳞癌14例，中分化鳞癌42例，低分化鳞癌24例。对照组32〜75岁，中位年龄49岁。收集三组患者的结肠组织标本，其中对照组

4、标本来源于结肠息肉组织，结肠癌组标本來源于结肠活检和手术治疗，癌旁组标本来源于结肠癌旁组织手术，结肠癌患者所有手术标本均经过本院病理学专家明确诊断，在患者手术中取病理标本，标本放入液氮屮速冻后-80°C条件下保存待检，样木获得了伦理委员会批准并签署知情同意书。1.2方法1.2.1目标标本相关的DNA和RNA提取均按试剂盒说明书提供的方法提取三组结肠组织DNA与RNA,并采用琼脂糖凝胶电泳并鉴定DNA和RNA完整性。1.2.2TI-10和TFN-Y基因启动子区甲基化检测按照EZDNAMethy1ation~Go1dTMKit试剂盒（购自美国Zymoresearch公司）操作说明对DNA进行

5、甲基化修饰及纯化。在NCBI线上检索IFN-Y（J00219）和TI-10(AF418271)基因启动子区序列,MethylPrimerExpressV2.0软件进行分析核对参考物[4],亚硫酸氢盐测序法(BSP)检测IL-10基因启动子。基化特异性PCR(MSP)检测IFN-y基因启动子区非甲基化及甲基化基因，IL-10和IFN-Y基因启动子区序列一甲基化特异性PCR和RT-PCR引物序列如表1所示。基化结果判断：出现甲基化特界性引物扩增产物判断定为甲基化，仅非甲基化特异性引物扩增产物判断定为非甲基化。1.3统计学处理数据采用SPSS17.0软件进行统计学分析，计量资料以(x±s)表示

6、，采用t检验，计数资料采用字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1三组结肠组织IL-10和IFN-ymRNA的表达比较三组IL-10和IFN-ymRNA水平比较，差异均有统计学意义(P〈0.05),其中结肠癌组和癌旁组TI-10mRNA均高于对照组(1X0.05),IFN-ymRNA均低于对照组(P<0.05),结果见表2。2.2三组H厂10和TFN-y基因启动子区甲基化率比较三组结肠组织IL-10基因启动子区-320、-350、-352.-373位点甲基化率进行相互比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；三组结肠组织基因启动子区-110.-185位点甲基化率进行相互比较

7、，差异均有统计学意义(P癌旁组>对照组，差异均有统计学意义(P<0.05),结果见表3；三组结肠组织提取DNA的TFN-y基因启动子区甲基化状态见电泳图lo2.3IL-10基因启动子区通过在线的TFSEARCII软件分析发现，IL-10基因启动子区包含有STAT3或EtsT、HSF、CCAAT-box、HSF与A卩-4、ER共5个转录因子结合域，见图2。3讨论机体Thl介导的细胞免疫在体内抑制肿瘤牛发展屮扮演的重要角色，而Thl向T