人源化单克隆抗体的构建技术.doc

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1、人源化单克隆抗体的构建技术摘要：单克隆抗体从问世到现在已广泛应用于临床，经历了一段曲折的发展历程。其中人源化抗体是一个重要的里程碑，并伴随着一系列重大的技术革新，如PCR技术、抗体库技术、转基因动物等。抗体技术从最初的嵌合抗体、改型抗体逐渐发展为今天的人源化抗体。本文综述了人源化单克隆抗体的构建技术。关键词：人源化，单克隆抗体，构建从20世纪70年代英国学者Milstein和德国学者Kohler利用细胞融合技术首次成功地制备出单克隆抗体以来[1]，单克隆抗体在医学、生物学、免疫学等诸多学科中发挥了巨大的作用。单克隆抗体可用于分析抗原的细微

2、结构及检验抗原抗体未知的结构关系，还可用于分离、纯化特定分子抗原，甚至用于临床疾病的诊断和治疗等。然而，单克隆抗体技术在临床治疗应用中的进展却很慢，主要原因是目前单克隆抗体大多是鼠源性的，而鼠源性单克隆抗体应用于人体治疗时存在诸多问题：一是不能有效地激活人体中补体和Fc受体相关的效应系统；二是被人体免疫系统所识别，产生人抗鼠抗体(humanantigenmouseantibody，HAMA)；三是在人体循环系统中被很快清除掉。因此，在保持对特异性抗原表位高亲和力的基础上进行人源化改造，减少异源抗体的免疫原性，成为单克隆抗体研究的重点[2]

3、。随着对抗体基因的研究和DNA分子重组技术的应用，通过基因改造获得特异性抗体成为可能。1989年Huse等首次构建了抗体基因库，从而使抗体的研究从细胞水平进入到分子水平，并推动了第3代抗体—基因工程抗体技术的发展。至此，抗体的产生技术经历了三个阶段：经典免疫方法产生的异源多克隆抗体；细胞工程产生的鼠源单克隆抗体及基因工程产生的人源单克隆抗体。人源化抗体就是指抗体的可变区部分（即Vh和Vl区）或抗体全部由人类抗体基因所编码。人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。人源化抗体的形式也从最初的嵌合抗体、改型抗体等逐步发展为今天

4、的人源化抗体。1嵌合抗体的构建抗体分子与抗原结合特异性由L链和H链V区决定，抗体C区可作为异源蛋白诱发免疫反应，产生抗小鼠抗体（humananti-mouseantibody，HAMA）。将小鼠单克隆抗体C区用人抗体C区代替而拼接成嵌合抗体(chimericantibody)，这样表达的抗体分子中轻重链的V区是异源的，而C区是人源的，这样整个抗体分子的近2/3部分都是人源的。这样产生的抗体，减少了异源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。嵌合抗体(chimericantibody)属第一代人源化抗体，有60%～70%的

5、人源区域，是目前研究较多也较为成熟的基因工程抗体，人—鼠嵌合抗体基因工程改造策略主要包括：（1）从鼠杂交瘤中克隆V区基因。（2）选择合适的人C区基因。（3）构建载体并在一定表达系统中表达根据嵌合抗体H链和L链基因是否克隆、表达与同一载体与否，可将基因工程嵌合抗体的表达分为共转染表达模式(co-transfectionmodel)和单载体转染表达模式(singlevectortransfectionmodel)。根据所需达到的功能，人重链的恒定区可为IgA、IgD、IgE、IgG或IgM中的一种。通常，人源抗体包括嵌合抗体常采用IgG，因其

6、对不同的亚基都合适。1986年，Jones[3]等用寡核苷酸构建出小鼠抗半抗原——4-羟基-3-硝基苯乙酰基己酸(NP)的免疫球蛋白VH基因，其中编码VH互补决定区(CDR)的序列来自小鼠的单抗，编码构架区(FR)的序列来自与鼠抗NP单抗的FR同源程度较高的人骨髓瘤蛋白，通过人抗NP重链可变区基因(hVHNP)与含有人重链恒定区序列的表达载体连接，并转染到只分泌抗NP轻链的小鼠杂交瘤细胞J558L中，结果获得可特异结合NP的人源化嵌合抗体。康向东等[4]从分泌抗人甲状腺球蛋白的杂交瘤细胞株hTg-60中提取总RNA，逆转录-酶链聚合反应(

7、RT-PCR)扩增出鼠源性单克隆抗体hTg-60的VH及VL基因，经基因测序分析，设计出人源化抗体的基因引物，获得抗Tg单克隆抗体人源化VH及VL基因并将其克隆入真核表达载体，转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，表达人源化嵌合hTg抗体。成功获得了6株能稳定分泌抗hTg人源化嵌合抗体的细胞株。2CDR移植抗体的构建尽管嵌合抗体Fc段换成了人源化，但V区保留的鼠源性保守序列仍能诱发HAMA，因此嵌合抗体不能彻底地消除鼠免疫原性，还需进一步对鼠源抗体的V区进行改造。抗体V区由CDR和骨架区（FR）组成。CDR是抗体识别和结合抗原的区域，直接决定了

8、抗体的特异性，而骨架区序列及其立体结构较为保守，是嵌合抗体诱发HAMA的主要原因，因此将鼠单克隆抗体CDR移植到人单克隆抗体的V区框架上，使人单克隆抗体获得鼠单克隆抗体结合特异性，并减少异源性