微阵列比较基因组杂交技术

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1、万方数据微阵列一比较基因i组豢蠢嘲翻麓鞠黼蠢鬃鬻肿瘤研究中的应博爹誊攀鬻薰蒸鬻戮鬻蒸鬻辫j。j?『．。管。i警毒鬻t鬻凌鬻毫豢i毫≥。≤芬≯鏊-一f．一B

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3、。嚣鲁i；§专≈一o#·‘i。j。“孙新房1，2综述，王新保1，余传定1审校(1．浙江省肿瘤医院，浙江杭州310022；2．浙江中医药大学，浙江杭州310053)ApplicationofArray——ComparativeGenomicHybridizationinCancerResearchSUNXin-fang,WANGXin-

4、6∞．YUChuan—ding摘要：微阵列比较基因组杂交(a咖y—CGH)技术是将DNA克隆或cDNAs做成微阵列，代替传统CGH法中中期染色体作为杂交靶，不仅使分辨率提高．甚至可以确定肿瘤相关基因并提供精确的定位。全文综述Array—CGH的原理、方法及其在肿瘤学中的应用和意义。关键词：微阵列一比较基因组：杂交：肿瘤中图分类号：R329．2；R73—3文献标识码：A文章编号：1004—0242(2007)07—0525—04微阵列比较基因组杂交farray—comparativege．nomiehybridi

5、zation，Array—CGH)技术是将DNA克隆或cDNAs做成微阵列，代替传统CGH检测中将中期染色体作为杂交靶进行检测，不仅使分辨率提高，而且还可以确定肿瘤相关基因并提供精确的定位。同时可经计算机软件识别每条染色体，克服了需要经验丰富的人员识别染色体的限制．为快速全面地分析肿瘤组织DNA拷贝数的变化，以及染色体不稳定性的检测提供了较为理想的方法。本文就该技术原理、方法及其在肿瘤研究中的应用作一简单的综述。1微阵列一比较基因组杂交概述1．1Array—CGH基本原理Array—CGH与CGH相似，但它是用

6、DNA克隆或cDNAs微阵列代替中期染色体铺片作为杂交靶．即将等量的不同荧光标记的待测和参照DNA经人Cot一1DNA封闭非特异性重复序列后，同时杂交到由DNA克隆或cDNAs组成的微阵列上。用微阵列每个靶点上的两种信号的荧光比例反映待测基因组DNA在相应的序列或基因上的拷贝数变化【㈨。1．2方法1．2．1微阵列制备微阵列可以为DNA克隆微阵列和cDNAs微阵收稿日期：2006—06—20：修回日期：2007—06—08中国肿瘤2007年第16卷第7期列。DNA克隆是在BAC、PAC或YAC载体中克隆的DNA片

7、段。cDNAs微阵列，可以从样本中提取总RNA，再分离mRNA，然后将得到的cDNAs进行PCR扩增。用专门的仪器将DNA克隆或cDNAs点样至覆盖特定介质的玻片上，按照在染色体中的分布，确定靶点的排列顺序。为了得到精确的结果，每个靶点可重复点样2～10次。点样后，立即将玻片在80℃烘烤10min，制成微阵列玻片，存储在带有干燥剂的盒子里，室温保存[1’z，蜘。1．2．2待测DNA和参照DNA制备及标记待测DNA可以来自肿瘤细胞系、冷冻或石蜡包埋的肿瘤组织。应尽可能选择具有典型组织学特征的肿瘤细胞，弃除坏死组织

8、和炎症区及周边正常细胞，以免干扰。使用标准的酚一氯仿一异戊醇提取法分离肿瘤细胞和组织中的DNA。对于甲醛固定、石蜡包埋组织，可以用激光捕获显微切割法(LCM)获得肿瘤组织，提取DNA．再用变性引物介导的PCR(DOP—PCR)扩增和标记[8]，参照DNA来源于健康人血液中的白细胞或同一患者同一器官中正常组织。对探针可以进行直接或间接荧光标记。标记方法有以下几种：①缺口平移法；②随机引物法；③DOP—PCR法；④顺铂一荧光素连接法[1，91等。标记完成后用SephadexG5旋转柱去除未结合的核苷酸【1]。1．2

9、．3杂交将不同荧光标记的待测和参照DNA(各1¨q)525万方数据与人Cot．1(60斗)混合，封闭非特异重复序列，降低本底作用。然后．q将待测和参照DNA80℃热变性10min。37℃孵育1～2h，再与已经预热的微阵列37℃杂交过夜，杂交后洗涤微阵列玻片，盖上盖玻片。对于DNA克隆微阵列，可以用DAPI复染。有助于定位靶克隆[1．2，镧。1．2．4数据处理和图像分析用共聚焦扫描装置或带有冷光源相机的光学设备获取图像，并用专门的分析软件处理数据。需要确定实际的靶区域、靶信号强度和局部背景强度。从靶信号强度中扣除

10、局部背景得到靶荧光比例。将正常标本在微阵列全部靶点的平均荧光比例调整为1．代表无DNA拷贝数变化。利用全部靶点的平均荧光比例(M)和标准差(S)确定拷贝数变化的界限。获得和缺失分别定义为>(M+2s)和<(M一2s)．高水平扩增定义为>(2M+2s)t7]。分析时去除在正常样本中荧光信号不知的点(荧光信号高出背景<20％)和有过多荧光残骸的点【8]。DNA拷贝数图像可以用移动平均值(m