微阵列—比较基因组杂交技术及其在肿瘤研究中的应用_论文

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1、微阵列—比较基因组杂交技术及其在肿瘤研究中的应用【摘要】微阵列比较基因组杂交(array-CGH)技术是将DNA克隆或cDNAs做成微阵列，代替传统CGH法中中期染色体作为杂交靶，不仅使分辨率提高，甚至可以确定肿瘤相关基因并提供精确的定位。全文综述Array-CGH的原理、方法及其在肿瘤学中的应用和意义。【关键词】微阵列-比较基因组微阵列比较基因组杂交(array-comparativegenomichybridization，Array-CGH)技术是将DNA克隆或cDNAs做成微阵列，代替传统CGH检测中将中期染色体作为杂交靶进行检测，不仅使分辨率提高，而且还可以确定肿瘤相关基因并

2、提供精确的定位。同时可经计算机软件识别每条染色体，克服了需要经验丰富的人员识别染色体的限制，为快速全面地分析肿瘤组织DNA拷贝数的变化，以及染色体不稳定性的检测提供了较为理想的方法。本文就该技术原理、方法及其在肿瘤研究中的应用作一简单的综述。1微阵列—比较基因组杂交概述Array-CGH基本原理16/16Array-CGH与CGH相似，但它是用DNA克隆或cDNAs微阵列代替中期染色体铺片作为杂交靶，即将等量的不同荧光标记的待测和参照DNA经人Cot-1DNA封闭非特异性重复序列后，同时杂交到由DNA克隆或cDNAs组成的微阵列上。用微阵列每个靶点上的两种信号的荧光比例反映待测基因组D

3、NA在相应的序列或基因上的拷贝数变化[1～5]。方法微阵列制备微阵列可以为DNA克隆微阵列和cDNAs微阵列。DNA克隆是在BAC、PAC或YAC载体中克隆的DNA片段。cDNAs微阵列，可以从样本中提取总RNA，再分离mRNA，然后将得到的cDNAs进行PCR扩增。用专门的仪器将DNA克隆或cDNAs点样至覆盖特定介质的玻片上，按照在染色体中的分布，确定靶点的排列顺序。为了得到精确的结果,每个靶点可重复点样2～10次。点样后，立即将玻片在80℃烘烤10min，制成微阵列玻片，存储在带有干燥剂的盒子里，室温保存[1，2，4～7]。待测DNA和参照DNA制备及标记待测DNA可以来自肿瘤细

4、胞系、冷冻或石蜡包埋的肿瘤组织。应尽可能选择具有典型组织学特征的肿瘤细胞，弃除坏死组织和炎症区及周边正常细胞，以免干扰。使用标准的酚—氯仿—异戊醇提取法分离肿瘤细胞和组织中的16/16DNA。对于甲醛固定、石蜡包埋组织,可以用激光捕获显微切割法（LCM）获得肿瘤组织，提取DNA，再用变性引物介导的PCR（DOP-PCR）扩增和标记[8]，参照DNA来源于健康人血液中的白细胞或同一患者同一器官中正常组织。对探针可以进行直接或间接荧光标记。标记方法有以下几种：①缺口平移法；②随机引物法；③DOP-PCR法；④顺铂—荧光素连接法[1，9]等。标记完成后用SephadexG5旋转柱去除未结合的

5、核苷酸[1]。杂交将不同荧光标记的待测和参照DNA（各1μɡ）与人Cot-1（60μɡ）混合，封闭非特异重复序列，降低本底作用。然后将待测和参照DNA80℃热变性10min。37℃孵育1～2h，再与已经预热的微阵列37℃杂交过夜，杂交后洗涤微阵列玻片，盖上盖玻片。对于DNA克隆微阵列，可以用DAPI复染，有助于定位靶克隆[1，2，4～8]。数据处理和图像分析16/16用共聚焦扫描装置或带有冷光源相机的光学设备获取图像，并用专门的分析软件处理数据。需要确定实际的靶区域、靶信号强度和局部背景强度。从靶信号强度中扣除局部背景得到靶荧光比例。将正常标本在微阵列全部靶点的平均荧光比例调整为1，代

6、表无DNA拷贝数变化。利用全部靶点的平均荧光比例（M）和标准差（s）确定拷贝数变化的界限。获得和缺失分别定义为＞（M+2s）和＜（M-2s），高水平扩增定义为＞（2M+2s）[7]。分析时去除在正常样本中荧光信号不知的点（荧光信号高出背景＜20％）和有过多荧光残骸的点[8]。DNA拷贝数图像可以用移动平均值（movingaverage）（5个相邻的靶）显示。移动平均值用于减少靶信号交叉引起的误差和降低背景[8，9]。可行性检测和质量控制Urban等[10]用已知有β-globin位点缺失的人用Array-CGH法进行检测验证Array-CGH检测染色体基因组缺失或扩增是否可靠，结果均检

7、测到了缺失的存在，证明该芯片系统可以准确地检测基因或基因组的缺失。Veltman等[11]为用Array-CGH法检测膀胱肿瘤患者DNA拷贝数变化，为确定该技术及该芯片在检测基因或基因组改变的可信性，先用正常人对正常人的组织进行对比试验，结果没有缺失或扩增的信号出现。而在膀胱癌患者的组织中检测到了明显有扩增或缺失的信号发生。而这些缺失或扩增的部位，含有相应的癌基因或抑癌基因。证明此方法在检测基因扩增或缺失中，得出的结果是可信的。Array-CG