微阵列—比较基因组杂交技术及其在肿瘤研究中的应用论文

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1、微阵列—比较基因组杂交技术及其在肿瘤研究中的应用论文【摘要】微阵列比较基因组杂交(array-CGH)技术是将DNA克隆或cDNAs做成微阵列，代替传统CGH法中中期染色体作为杂交靶，不仅使分辨率提高，甚至可以确定肿瘤相关基因并提供精确的定位。全文综述Array-CGH的原理、方法及其在肿瘤学中的应用和意义。【关键词】微阵列-比较基因组微阵列比较基因组杂交(array-parativegenomichybridization，Array-CGH)技术是将DNA克隆或cDNAs做成微阵列，代替传统CGH检测中将中期染色体作为杂交靶进行检测，不仅使分辨

2、率提高，而且还可以确定肿瘤相关基因并提供精确的定位。同时可经计算机软件识别每条染色体.freelRNA，然后将得到的cDNAs进行PCR扩增。用专门的仪器将DNA克隆或cDNAs点样至覆盖特定介质的玻片上，按照在染色体中的分布，确定靶点的排列顺序。为了得到精确的结果,每个靶点可重复点样2～10次。点样后，立即将玻片在80℃烘烤10min，制成微阵列玻片，存储在带有干燥剂的盒子里，室温保存1，2，4～7。1.2.2待测DNA和参照DNA制备及标记待测DNA可以来自肿瘤细胞系、冷冻或石蜡包埋的肿瘤组织。应尽可能选择具有典型组织学特征的肿瘤细胞，弃除坏死

3、组织和炎症区及周边正常细胞，以免干扰。使用标准的酚—氯仿—异戊醇提取法分离肿瘤细胞和组织中的DNA。对于甲醛固定、石蜡包埋组织,可以用激光捕获显微切割法（LCM）获得肿瘤组织，提取DNA，再用变性引物介导的PCR（DOP-PCR）扩增和标记8，参照DNA来源于健康人血液中的白细胞或同一患者同一器官中正常组织。对探针可以进行直接或间接荧光标记。标记方法有以下几种：①缺口平移法；②随机引物法；③DOP-PCR法；④顺铂—荧光素连接法1，9等。标记完成后用SephadexG5旋转柱去除未结合的核苷酸1。1.2.3杂交将不同荧光标记的待测和参照DNA（各1

4、μɡ）与人Cot-1（60μɡ）混合，封闭非特异重复序列，降低本底作用。然后将待测和参照DNA80℃热变性10min。37℃孵育1～2h，再与已经预热的微阵列37℃杂交过夜，杂交后洗涤微阵列玻片，盖上盖玻片。对于DNA克隆微阵列，可以用DAPI复染，有助于定位靶克隆1，2，4～8。1.2.4数据处理和图像分析用共聚焦扫描装置或带有冷光源相机的光学设备获取图像，并用专门的分析软件处理数据。需要确定实际的靶区域、靶信号强度和局部背景强度。从靶信号强度中扣除局部背景得到靶荧光比例。将正常标本在微阵列全部靶点的平均荧光比例调整为1，代表无DNA拷贝数变化。

5、利用全部靶点的平均荧光比例（M）和标准差（s）确定拷贝数变化的界限。获得和缺失分别定义为＞（M+2s）和＜（M-2s），高水平扩增定义为＞（2M+2s）7。分析时去除在正常样本中荧光信号不知的点（荧光信号高出背景＜20％）和有过多荧光残骸的点8。DNA拷贝数图像可以用移动平均值（movingaverage）（5个相邻的靶）显示。移动平均值用于减少靶信号交叉引起的误差和降低背景8，9。1.3可行性检测和质量控制Urban等10用已知有β-globin位点缺失的人用Array-CGH法进行检测验证Array-CGH检测染色体基因组缺失或扩增是否可靠，结

6、果均检测到了缺失的存在，证明该芯片系统可以准确地检测基因或基因组的缺失。Veltman等11为用Array-CGH法检测膀胱肿瘤患者DNA拷贝数变化，为确定该技术及该芯片在检测基因或基因组改变的可信性，先用正常人对正常人的组织进行对比试验，结果没有缺失或扩增的信号出现。而在膀胱癌患者的组织中检测到了明显有扩增或缺失的信号发生。而这些缺失或扩增的部位，含有相应的癌基因或抑癌基因。证明此方法在检测基因扩增或缺失中，得出的结果是可信的。1.4Array-CGH的特点Array-CGH技术具有两方面明显优势：①灵敏度和精确性：由于染色体DNA以高度密集和超

7、螺旋的形式存在着，因此传统CGH只有在DNA序列缺失达10Mb～20Mb（细胞株）或20Mb～30Mb（原发肿瘤）以上或序列扩增时扩增子与扩增拷贝数之积至少2Mb才被检测出来。故传统CGH所提供的信息中必然包含有为数众多的基因，需要作进一步的精确定位。Array-CGH避开了复杂的染色体结构，所杂交的靶序列仅为包含了少数基因的短DNA片段，所以能找出传统CGH检测不出的DNA序列拷贝数的差异，并同时将扩增或缺失的范围精确地定位在某个或某几个已知基因或未知基因上。②自动化、程序化：染色体带型的复杂性和个体差异决定了核型分析不可能全部实现机械化，必须依

8、靠经验丰富的细胞遗学家对核型分析软件得出的结果进行校正后才能进一步分析基因组的不平衡性。因此传统CGH的技术受人为因素的限