细胞培养相关操作.doc

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1、细胞培养相关操作一、细胞室注意事项：1、进门换拖鞋，操作时要戴乳胶手套；2、两道门切勿同吋打开；3、从准备室（外间）带入操作室（内间）的东西须喷酒精消毒，戴于•套后也须喷酒精；4、培养基保存在4°C冰箱，不可放入・20°C冻存；牛血清置于-20°C冻存，使用前放入4°C融化，切勿放于室温融化；5、开瓶盖时均须将瓶口过火消毒；6、取完试剂盖上瓶盖时亦须将瓶口和盖子过火消毒；7、如培养基滴在桌上或瓶舉上，须立即用酒精棉球擦净，以免滋生细菌。二、瓶子的消毒灭菌1、Flask的消毒：自来水泡一天，盐酸泡一天，NaOH泡一天，ddH2O泡一天,酒精泡一天，最后再微波炉加热灭菌；

2、（盐酸：1%,浓盐酸算作100%；NaOH：1%）2、玻璃瓶可用灭菌锅灭菌。三、细胞复苏1>Flask微波炉加热灭菌；2、在Flask中加入少量培养基（2-3ml,Flask倒下吋可铺展开即可）；注：冻存细胞时需加DMSO（二甲亚矶），DMSO有利于细胞保存，但对活细胞有毒性，故需加培养基使细胞将DMSO释放于其中，同时也使细胞铺开。3、融化细胞液，将细胞液（200卩1或500卩1）分别加入Flask；4、将Flask放倒，前后、左右摇晃，注意用力均匀，以免细胞堆积；注：切勿画圈混匀，否则有向心力，细胞易堆积在外侧。5、放置几分钟，使细胞贴壁，显微镜观察；6、吸取Fl

3、ask中的培养基，弃去，换上新的培养基；注：细胞释放出的DMSO溶于培养基中，所以需要换培养基。7、放入培养箱培养（27°C~29°Oo注：复苏后的细胞，每1~2天需换一次培养基。四、Sf9细胞传代1>准备好新的Flask,取出培养细胞的原Flask,备好培养基（Sf-900IISFM,10%FBS）；2、培养基瓶口过火、打开。所有Flask瓶口过火、打开（注意瓶盖和瓶体须匹配，不可混淆）。蹑子过火，用其取出滴管，根部过火后套上胶头，管体过火；3、每个新的Flask中加入两管半培养基；4、在原Flask中加入1管培养基，吹打使贴壁细胞悬浮；注：选用完好的吸滴管，管口细

4、可保证吹力足够吹下细胞；吹打次数尽量少，但也要保证将细胞吹下；尽量不要吹起气泡；5、每个新的Flask中加入约20滴细胞悬液后，将Flask放平，前后左右摇动以使细胞铺开；6、静H-10min后，显微镜观察细胞是否贴辟；7、细胞贴舉后，吸出培养基，换入新的培养基（每个Flask中加两管半）;8、放入培养箱培养（27°C~29°Oo注：其后每1~2天需换一次培养基，大约4~5天后可再次传代。五、细胞冻存（BmN细胞）1、将两瓶细胞转入10ml离心管，4000rpm离心5min；2、去上淸，加720pilBmN冻存液+80卩1DMSO,吹打悬浮细胞;3、转入冻存管，放入冻

5、存盒，・70°C过夜；4、放入液氮罐长期保存。注：Sf9细胞一般一瓶半冻存一管，实际用量视情况而定。(By:GeXie)