细胞培养实用操作

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1、细胞培养cellcultivation1665年植物学家罗伯特.琥克第一次引入“细胞”概念，1906年诺贝尔医学生理学奖授于关于细胞生物学研究、N.S结构研究方面的工作Golgi与cajal。1907年开始组织培养工作。1925年wilson提出解决生物学问题的关键最终将在细胞中寻找到。随着科学的发展及技术进步，从事生物医学研究的学者越来越迫切地认为利用细胞生物学技术解决实际工作中所遇到的问题是非常必要的，它对任何生命科学实验都是必不可少的。细胞培养的概念：指从体内取出组织后，分离的细胞在模拟体内生理环境等特定的条件下进行孵育培养，使之生存、生长，并维持其结构和功能的方法。一细胞培养的优

2、点及缺点：（一）细胞培养的优点：1．研究的对象是活的细胞：可评定细胞形态结构、生理功能、生化特征，它是其他方法无法取代的。2．研究的条件可人为控制：可控制pH、T、O2张力、CO2张力等物理条件，同时也可施加化学、生物等因素作为条件而进行实验、观察。这些因素可严格控制。3．研究的样本可以达到比较均一性、重复性好：如细胞株则可达到均一性，而且纯化。4．研究的内容可以便于观察、检测和记录：倒置显微镜及光镜可观察细胞形态、电镜可以观察细胞超微结构；同位素标记、放射免疫、免疫组化可检测细胞内物质合成、代谢、定位；流式细胞仪可检测细胞周期、细胞表面抗原（鉴定细胞性质）、凋亡等；PCR检测；自动酶标

3、仪检测等等。5．研究的经费相对较经济。6．研究范围比较广泛：细胞学、免疫学、肿瘤学、生化学、组织胚胎学、遗传学、分子生物学等。可用于以下研究：①细胞与细胞之间相互作用：细胞间粘着、侵袭、接触抑制等。②细胞内部与细胞外界之间作用：细胞对外界刺激（药物、化学试剂、物理因素、生物因素等）反应，细胞内产物的改变。③细胞内胞质的活动：能量代谢及蛋白质合成变化。④胞质与胞核之间的流动：RNA自胞核至胞质，胞质激素受体复合物易位至核等。（二）细胞培养的缺点：与体内条件存在差别，长期体外培养可使细胞形态、功能都发生一定程度的改变。二细胞培养条件：1．细胞培养所需设备：细胞培养室（超净工作台、倒置显微镜、

4、CO2孵育箱、离心机、冰箱等）；清洁室（浸泡玻璃器皿的清洁液、浸泡塑料和橡皮制品的0.5％HCl和1％NaOH、蒸馏水、烤箱等）。2．无菌技术：工作环境的无菌处理（紫外线照射）、细胞培养所用器材的无菌处理（高压消毒或紫外线照射）、实验者的无菌操作技术等。防止微生物污染（细菌、霉菌、黑胶虫）。3．培养液：基本的细胞培养液由必需氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖、血清（内含血浆蛋白、肽类、脂肪、生长因子、激素、贴壁因子等）等组成。一般常用RPMI1640、DMEM、F12、M199等粉剂，用三蒸水配成液体，内加入NaHCO3及二抗10万/L，调整pH7.2-7.4，除菌（孔经0.22μm），分装

5、保存、备用；应用时需加入新生（或胎）牛血清。细胞培养时还需配制除菌的PBS液、Hank’s液、胰酶等备用。三．培养中的细胞系生长方式：1．悬浮生长细胞：细胞不贴壁，常呈圆形。培养细胞离心沉淀，再悬于新培养液中计数，调整细胞浓度为5×104-5×105个细胞/ml。如白血病细胞。2．贴壁生长细胞：细胞贴壁，常呈多角形或梭形。倾去培养液、用0.25％胰蛋白酶或0.1％胰蛋白酶0.02％EDTA消化、终止消化、离心去上清、再悬于新培养液中计数，调整细胞浓度为5×104-1×105个细胞/ml。如实体瘤细胞。胰蛋白酶浓度太高可造成细胞裂解和活力的丧失。EDTA的作用是增加细胞分离，加强胰酶的作用

6、。有时可用除菌的PBS液Hank’s液、生理盐水洗细胞。细胞计数：用台盼蓝染料拒染试验进行血细胞计数器计数法：4个大格之和÷4×2×104个细胞/ml四．细胞的冻存与复苏：1．细胞的冻存：收集细胞，加入冻存液（悬浮生长细胞5×106-107/ml,贴壁生长细胞3×106-5×106/ml），采取分步的方式达到临界冻存点：4℃-45ˊ，-20℃-45ˊ，液氮罐气态45ˊ，进入液态保存（也可-80℃低温冰箱保存）。采取分步的方式达到临界冻存点使细胞内部不能形成冰晶和抑制水外流。冻存液配制：DMSO、甘油是细胞保护剂，防止细胞内冰晶形成。20％血清、10％DMSO、70％1640培养液；或90

7、％血清、10％DMSO，更可防止细胞内冰晶形成。2.细胞的复苏：应快速融化，并加入培养液，离心，去上清液，加入新培养液置于培养瓶中培养。五．肿瘤细胞培养：肿瘤细胞的培养是研究癌变机制和肿瘤细胞生物学特性的极好手段。（一）它有以下优点：1．可免受体内因素的影响，从而便于探索各种物理、化学和生物等因素对瘤细胞生命活动的影响。2．便于研究肿瘤细胞的结构与功能。3．可长期保存，便于观察细胞遗传性行为。4．可用于快速筛选新抗癌药物（初筛新抗癌