细胞培养技术实用篇

《细胞培养技术实用篇》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、细胞生物学技术第三章细胞培养基本技术王云动脉粥样硬化研究所细胞培养的优点活细胞：长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结构和生命活动可控制：选择特定的细胞种类、性质、阶段可控制调节条件：物理、化学、生物等可采用各种研究技术、记录方法样品均一性：来源于同一组织同一种细胞经济、规模局限性人工模拟的条件和体内实际情况仍不完全相同缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和细胞相互间的影响体外培养的细胞生活在缺乏动态平衡的环境环境中，必然发生变化。本章主要内容细胞培养的基本操作技术原代培养(primaryculture)传代培

2、养(subculture)体外培养细胞的影响因素细胞培养污染及对策培养细胞的生长测定方法细胞冻存和复苏细胞培养中的常用术语组织培养(TissueCulture)：指的是从体内取出组织，模拟体内生理环境，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。器官培养（OrganCulture）：培养的是器官的原基、器官的一部分或整个器官，使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法。细胞培养(CellCulture)：培养物是单个细胞和细胞群。细胞培养中的常用术语原代培养（primaryculture）：从体内取出细胞或组织的第一次

3、培养。传代（passage）也称再培养。无论是否稀释，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代或传代培养。也称再培养。细胞系（cellline）：原代培养物经首次传代成功后即为细胞系细胞培养中的常用术语细胞株（cellstrain）：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养物称细胞株。汇合（confluent）：细胞相互连接成片占据所有底物面积。接触抑制（contactinhibition）：细胞汇合相互接触后失去运动的现象一、细胞培养基本操作技术由于体外培养的细胞没

4、有抗感染能力，因此防污染是决定培养成功的首要条件。一切操作需要保证无菌和有条不紊。培养前准备制定好实验计划和操作程序有关数据的计算要事先做好。准备各种所需器材和物品，清点无误后将其放置在操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。消毒地面每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面—次(拖布要专用)，紫外线照射消毒30-50min超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。然后紫外线消毒30min。消毒时工作台面上用品布局合理，不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线降低消毒效

5、果。一些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。洗手和着装原则上和外科手术相同。仅做观察不做培养操作时，可穿着细胞培养室内紫外线照射30min的清洁工作服在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用75％酒精消毒手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。专用鞋或带鞋套火焰消毒在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯。按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。如实验用品需火焰灭菌，冷却后接触培

6、养细胞，以防烧死细胞。操作进行培养时，动作要准确敏捷不能太快，否则空气流动增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。组织细胞取材及培养的基本要求取材的组织用培养液浸泡，4℃运送，24h内尽快培养。取材时应严格无菌操作，避免对组织的机械损伤，尽量去除脂肪、神经、结缔、坏死组织，污染组织可用青链霉素和制霉菌素漂洗。原代培养，特别是正常细胞的培养，应采用营养丰富的培养液。一般来讲,胚胎组织较成熟个体的组织容易培养;分化低的较分化高的组织容易生长;肿瘤组织较正常组织容易培养。取材时应尽

7、量选用易培养的组织进行培养。为了便于以后鉴别原代组织的来源和观察细胞体外培养与原组织的差异性，原代取材同时保留组织学和电镜标本，对供体来源、部位及一般情况做记录。组织材料的分离机械法：适于较柔软的组织，如脑、脾、淋巴结、胸腺等。剪切组织为1mm3碎块后，置于组织匀浆器研磨或用注射器针芯挤压后过不锈钢筛网。化学法：胰蛋白酶、胶原酶、EDTA法细胞悬液的分离方法：低速离心法、密度梯度离心法细胞悬液的分离方法低速离心法：血液和体液等细胞悬液500-1000rpm离心5-10min。离心速度过大、时间过长，会造成细胞损伤

8、和死亡。密度梯度离心法：用离心法将细胞分到不同密度的梯度介质中，再分别吸出各层细胞。适于分离密度不等的细胞。常用介质有Ficoll400，Percoll，泛影葡胺等。胰蛋白酶（Trypsin）对细胞间的蛋白质水解，使细胞离散。消化效果与PH值、温度、酶浓度和组织块大小与硬度有关。适于消化细胞间质较少的软组织，能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。而对含结