《实用细胞培养技术》PPT课件

《《实用细胞培养技术》PPT课件》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、实用细胞培养技术◆在细胞培养中注意的一些问题◆细胞培养的实验程序◆细胞的复苏◆细胞的计数◆细胞(贴壁)的传代培养◆细胞的冻存◆悬浮细胞的培养方法在细胞培养中注意的一些问题环境由于体外培养细胞没有抗感染能力，若实验者粗心大意，技术操作不规范，也会导致污染。因而，每一项工作都必须做到有条不紊和完全可靠，特别是实验环境更为重要。1.培养室和超净台的消毒★培养室无菌培养室每天都要用速消净或0.2％的新洁而灭（苯扎溴铵）拖洗地面一次（拖布要专用），紫外线照射消毒30～50min。★超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗

2、，然后紫外线消毒30min。消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线，降低消毒效果。一些操作用具如移液器、废液缸。污物盒、试管架等用75％酒精擦洗后置于台内同时紫外线照射消毒。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线。2.培养前准备在开始实验前要制定好详细的实验计划和操作程序，有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置到培养室、超净台内，然后开始消毒。这样可以避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。3.培养条件★气体环境：95％空气加5

3、％CO2混和气体环境中。★PH值：7.2～7.4★温度：37℃培养实验用品的前期处理1.清洗和浸泡:(1)玻璃器皿:新的玻璃器皿在生产过程中常使玻璃表面呈碱性，并带有一些如铅和砷等对细胞有毒的物质，使用前必须彻底清洗。首先用自来水初步刷洗，5％稀盐酸溶液中浸泡过夜。然后用流水彻底冲洗3-5遍，单蒸馏水漂洗3遍，三（双）蒸水漂洗2遍，烘干备用。（2)塑料器皿:塑料器皿经冲净后，晾干，用2％NaOH浸泡过夜，自来水冲洗，5％盐酸浸泡30min，流水彻底冲洗3-5遍，单蒸馏水漂洗3遍，三（双）蒸水漂洗2遍，烘干备用。针

4、头式滤器不能泡酸液,用2％NaOH泡6～12小时,或者煮沸20分钟,常规冲洗干净，烘干（60℃以下）备用。使用前要包装，首先要装好滤膜，安装时注意光面朝上(凹向上)，然后用注射器回抽注入检查膜是否破损，安装好膜后将螺旋稍微拧松一些，放入铝盒内（或用牛皮纸包装）外层用纸包装备用。注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧；胶塞的处理：按常规冲洗干净烘干后，用2％氢氧化钠溶液煮沸30分钟（用过的胶塞要置入单蒸水中浸泡，再用沸水处理30钟），自来水洗净，烘干然后再泡入1％稀盐酸液中30分钟，用自来水彻底冲洗3-5遍，蒸

5、馏水漂洗3遍，三（双）蒸漂洗2遍，烘干备用。2.包装：在消毒前必须进行严格包装，以便消毒及储存，防止落入灰尘及消毒后再次被污染。包装纸（盒）表面用油性记号笔标明物品名称、消毒日期等。3.消毒:在组织细胞培养技术中，务必保证组织细胞在无微生物的条件下生长。防止培养物污染可通过消毒灭菌（将已存在的微生物去除）和无菌操作技术（防止已经消毒灭菌的用品被污染）来完成。（1）消毒灭菌的方法:★物理方法:湿热（高压蒸汽）、干热、紫外线照射线、过滤、离心沉淀等方法杀灭或去除微生物.★化学方法:使用化学消毒剂、抗菌素等杀灭微生物。

6、(2)消毒灭菌的时间：★干热消毒：一般在烤箱中进行，需加温到160℃，保持90～120min方能杀死芽孢。消毒完毕后不可马上将烤箱门打开，以免冷空气突然进入，影响消毒效果和损坏玻璃器皿或发生意外事故。★湿热消毒：一般使用高压蒸汽灭菌器进行消毒，要求是：◆不能装太满，保持消毒器内气体流通。◆在加热升压之前，打开排气阀门，使加热后消毒器内的残留冷空气排出。关闭排气阀门，开始升压，待达到所需要的压力时，开始记录时间，并控制压力恒定。◆一般物品：布类、金属器械、玻璃器皿等消毒的要求是15磅20min；常规使用液体：消毒1

7、5磅15min。橡胶和塑料用品：如滤器、EP管、离心管等高压10磅15min。★紫外线消毒：主要用于实验室房间里的空气、操作台表面及桌椅等消毒。时间为30min－2h左右。★过滤除菌消毒：适用于组织细胞培养使用的液体如血清、合成培养液、酶及含有蛋白质具有生物活性的液体等。4.细胞培养用液及培养基（液）:（1）水：双蒸水、三蒸水，可高压除菌。（2）平衡盐溶液（PBS)：PH为7.2－7.4，不含钙镁离子，可高压除菌。（3）消化液：★胰蛋白酶液：常用胰蛋白酶的浓度为0．25％，pH值7.2左右。需过滤除菌。★EDTA

8、液：常用浓度为0．02％，配制时采用无Ca2+、Mg2+平衡盐液溶解，高压灭菌后即可使用。★胰蛋白酶EDTA－Na2:需过滤除菌。胰蛋白酶和EDTANa2联合使用可提高消化率，但需注意EDTA不能被血清中和，消化后要彻底清洗，否则细胞易脱壁。★胶原酶：适于消化分离纤维性组织、上皮及癌组织，可使上皮细胞与胶原成分分离而不受损害。可用BSS或含血清的培养液配制，这样实验操作简