细胞培养相关技术

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1、细胞培养相关技术讲座石春薇2011年12月21日细胞培养Cellculture转染Transfection免疫荧光染色Immunofluorescencestaining体外培养细胞的特性培养细胞的生长方式贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长，如各种实体瘤细胞。悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面，如各种造血系统肿瘤细胞。细胞培养：模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞生存、生长并维持结构和功能的一门技术。基本概念原代培养动物或人组织直接用蛋白酶消化所得的细胞经体外培养后可贴壁或悬浮生长，在传代之前称为原代培养。传

2、代细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。细胞系cellline原代培养物成功传代后，则称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（finitecellline）；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（infinitecellline）。无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。细胞株cellstrain从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。通常将具有特殊性质或标志物的细胞群称为细胞株。美

3、国标准细胞库或细胞银行（ATCC）和人遗传突变细胞库（HGMR）、细胞衰老细胞库（CAR）等ATCC不仅是美国，也是世界最大的细胞库，是世界卫生组织WHO的国际培养细胞文献中心ATCC现液氮冻存有3200个已经过鉴定的细胞系，接纳来自世界各国已经鉴定的细胞予以贮存，同时也向世界各国的研究者或实验室免费提供研究用细胞（做盈利性研究时收费）武汉大学细胞典藏物中心细胞典藏物中心每代贴附生长细胞的生长过程游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期（平台期）游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。10分钟一4小时贴壁期：细胞附着于底物

4、上，游离期结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）潜伏期此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂机制：接触抑制、密度依赖性细胞培养方式群体培养（massculture），将含有一定

5、数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合后形成均匀的单细胞层克隆培养（clonalculture），将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆（clone）。一个细胞克隆中的所有细胞均来源于同一个祖先细胞。群体培养（左）和克隆培养（右）培养细胞生长的条件无污染环境:生物安全柜，超净工作台基质:玻璃，塑料…营养需要:氨基酸，碳水化合物，无机盐，缓冲系统，维生素…(商业化合成培养基)pH:7.2-7.4温度:37℃，细胞培养箱气体环境O2CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→

6、H++HCO3-实验准备实验用品：超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸，紫外灯，甲醛熏蒸器CO2培养箱倒置显微镜酶标仪、微孔板震荡器液氮罐自动双重纯水蒸馏器，纯水仪耗材：培养瓶，吸管，电动移液器，培养板，冻存管。。。CO2培养箱CO2培养箱设定的条件为37℃，5％CO2。使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。②保持培养箱内空气干净。定期消毒（90℃，14h或者紫外杀菌)。③箱内置4-6L蒸馏水，加入100ml饱和硫酸铜溶液，以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发，并抑制真菌污染。实验物品准备常用玻璃器

7、皿清洗浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、泡酸（24小时）、流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50℃烘干清洁液的配制细胞培养用液的配制水：新鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液PBS：NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO4.H2O1.56gKH2PO40.20加水至1000ml消化液胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％。

8、用滤器过滤除菌。胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。用