斑马鱼jak2a载体构建及其对红系造血功能影响的初步研究

《斑马鱼jak2a载体构建及其对红系造血功能影响的初步研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、第42卷第6期第699页华中科技大学学报(医学版)Vo1．42No．6P．6992013年12月ActaMedUnivSciTechnolHuazhongDec．2013斑马鱼jak2a载体构建及其对红系造血功能影响的初步研究*朱贤敏，姜利军，赵磊，关军，肖湘慧，张义成△华中科技大学同济医学院附属同济医院血液科，武汉430030摘要：目的构建jak2a野生型(wildetype，wt)载体并完成其在斑马鱼体内的过表达，运用邻联茴香胺染色观察其对红系造血的影响，为后续探讨斑马鱼骨髓增殖性疾病(myeloproliferati

2、vedisorders，MPD)模型的Jak／Stat信号通路奠定基础。方法根据jakZa基因GenBankNM一131093序列V581F突变位点上下游序列设计引物，以pGM—T—jak2aV581F质粒载体为模板进行PCR后，用DpnI酶对产物进行消化去除模板，转化感受态细菌DH5a，通过蓝白筛选酶切鉴定阳性菌落，小量提取质粒，NdeI限制性内切酶线性化pGM—T—jak2awt质粒，运用T7TranscriptAid酶对jakZa基因进行体外转录及加帽。经凝胶电泳对目的片段进行鉴定。以200ng／~L浓度jak2a—

3、wtmRNA加帽产物显微注射斑马鱼单胞期受精卵，运用邻联茴香胺染色检测其对红系增殖的影响。结果完成pGM-T～jak2aV581F的定点突变，成功构建pGM-T—jak2a—wt载体，DNA序列分析的结果与GenBank上的序列(NM一131093)一致，酶切线性化及体外转录加帽pGM—T—jak2a—wt，凝胶电泳鉴定RNA分子大小与预期完全一致。对过表达jak2a的鱼卵进行邻联茴香胺染色，发现斑马鱼卵黄囊及ICM区红细胞明显增多。结论成功完成斑马鱼pGMT—jak2aV581F基因定点突变并体外转录及加帽pGM-T—j

4、ak2awt，体内过表达jak2a对红系发生有显著影响。关键词：jak2a基因；定点突变；体外转录；邻联茴香胺染色中图分类号：R331．2D0I：10．3870／j．issn．16720741．2013．06．016ConstructionofJak2aVectorofZebrafishandEffectofItsoVerexpressiononErythroidHematopoiesisZhuXianmin，JiangLijun，ZhaoLeietalDepartmentofHematology，TongjiHospit

5、al，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，ChinaAbstractObiectiveToconstructtheiak2awtvectorandmakeitoverexpressinthezebrafishandthentoexaminetheeffectofsuchoverexDressiononerythroidhematopoiesisbyusingO—dianisidinestaininginanatt

6、empttolayafoundationforfollowinginvestigationofthesignalpathwayofJak／Statinmyeloproliferativedisorder(MPD)inthezebrafish．MethodsTheprimersweredesignedbasedontheforwardandreversesequencesoftheiak2aV581Fmutationsite(GelBankNM131093)．PlasmidspGM—T—jak2aV581Fwereuseda

7、sthetemplatestoamplifythefull—lengthpGM—T—jak2awtbyusingRT—PCR．AfterdigestedwithrestrictionendonucleaseD声I，thePCRproductwastransformedintocompetentcellsDH5d．Thepositiverecombinantcloneswereselectedandidentifiedbyblue／whitescreening．AsmallnumberofplasmidspGMT—ak2aw

8、ereextractedandlinearizedwithNdeI，followedbyinvitropGM—T—jak2atranscriptionwithT7TranscriptAidenzymeandcappingwiththecappedanalog．Afterwards，thetargetpr