对斑马鱼redd1和redd2基因在体功能及其作用机理的初步研究

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1、中国海洋大学博士学位论文对斑马鱼redd1和redd2基因在体功能及其作用机理的初步研究姓名：冯强申请学位级别：博士专业：药物化学指导教师：段存明201206对斑马鱼，利W和，Pd毖基因在体功能及其作用机理的初步研究对斑马鱼坨砌J和陀批基因在体功能及其作用机理的初步研究摘要REDD1和REDD2都属于DDIT(DNADalllageInducibleTrallscript)或者GADD(Gro嘶hA11restDNAD锄age)蛋白家族。目前认为这一家族成员参与生长发育、DNA损伤修复、细胞凋亡、炎症反应、压力应激、肿

2、瘤的发生发展等生理病理过程。REDDl受缺氧、氧化应激、饥饿等应激状态所调控，通过抑制mTOR信号通路来发挥作用。REDDl功能异常可导致帕金森病、肿瘤和骨骼肌萎缩等疾病。I迮DD2作为I也DDl的相似基因，与REDDl在功能上互补，共同参与mTOR信号通路的调节。尽管众多的研究集中在I冱DDl和I也DD2对mTOR信号通路的调节上，但最近的研究也发现DDIT蛋白家族其他成员还同时参与了wnt信号通路的调节，与爪蟾胚胎背腹轴的发育密切相关。众所周知，wnt信号通路调节控制着许多生命过程，包括生物体的生长、发育、疾病、衰

3、老和死亡等；也包括细胞形态与功能的分化与维持、免疫、应激、细胞癌变与细胞凋亡等。经典的W血信号通路是wnt配体通过一系列级联反应，最终稳定D．Catellin来发挥功能。砒’DDl和ⅪDD2是否通过Wnt信号通路来调控胚胎的早期发育，其机制如何目前尚不清楚。而且，关于REDDJ和REDD2基因的表达模式以及其在生理和病理过程中的作用大多来自体外细胞系的结果，对于两者的体内时空表达方式及其基因调控方式，尤其是其体内基因敲降后的表型研究还相对较少。本研究以斑马鱼为模型，克隆得到了斑马鱼旭栅和陀拢基因，对其时空表达方式和基因

4、表达调控做了初步研究；在此基础上，通过基因敲降和过表达等技术研究了，．Pd刃和旭d毖与经典Wnt信号通路的关系。结果显示，斑马鱼rP捌位于第12号染色体上，全长cDNA含有l，334bp，开放阅读框(OI谭)为663bp，编码220个氨基酸，含有3个外显子和2个内含子。坨d毖基因位于第14号染色体上，全长cDNA含有1，024bp，ORF为609bp，编码202个氨基酸，含有2个外显子和1个内含子。对其氨基酸序列比较分析、系统进化分析中国海洋大学博士学位论文以及染色体共线性分析表明，斑马鱼厂P捌和旭纰基因和蛋白质结构、

5、染色体定位与人类的同源基因相似。Reddl与Redd2蛋白在其羧基末端都含有相似的RTP801C结构域。在斑马鱼成鱼不同组织中，比删mRNA均有表达，除了在腮部表达量较弱，其他组织器官表达量均较高；而比讹mlⅢA仅在肝脏、肾脏和卵巢中的表达量较高，在其他组织中表达量较弱。不同发育时期胚胎的ImPCR检测发现，旭捌和您d犯基因在整个胚胎发育时期均有表达，但在0，2，4hourspostfeniliz“on(hpf)这一阶段的表达量最高。整胚原位杂交方法检测两者的空间表达方式发现，旭捌mI矾A在刚受精(2hpf)和1000

6、一细胞时期的胚胎(4hpf)中普遍表达，在50％外包时期(6hpf)，主要集中在生殖环区域，即中胚层前体细胞存在区域。在体节形成和随后的发育过程中，主要集中在前脊索神经板、尾部中胚层和头部外胚层等部位；愆肋mI矾A在早期没有特异信号，在体节形成以及随后的发育过程中，特异性表达在小脑与中脑之间的部位。基因表达调控方面，热激和饥饿均能不同程度的上调胚胎和成鱼体内愆删和旭拢IIl】[ⅢA的表达水平，但两者的上调方式不同；缺氧处理(物理缺氧／化学缺氧)不同发育时期的胚胎，仅上调陀捌mRNA的表达水平，而坨讹聊尉蚴水平不受缺氧调

7、控。进一步用基因敲降和过表达技术分析表明，敲降您蒯或者您纰基因均能使24hpf】还胎产生背部化表型，即卵黄囊延伸变短变窄，腹部尾鳍缺失以及尾部弯曲；过表达Reddl和Redd2均造成24hpf胚胎产生腹部化表型，即头部和脊索发育缺陷、尾部体节膨大。随后我们检测特异性标记胚胎背腹轴发育的基因发现，两者敲降均能扩大背部探针脚艘的表达范围而缩小腹部探针P阳J，和坩d的表达范围；相反，两者过表达能够缩小背部探针砌掰口秽c的表达范围而扩大腹部探针Pw』和wd的表达范围。表明Reddl和Redd2能够影响胚胎的背腹轴发育。近来的研

8、究发现，DDIT蛋白家族的另一个成员参与到Wnt信号通路的调控，在爪蟾胚胎的背腹轴发育过程中发挥作用。REDDl和REDD2是否也具有类似的功能目前还不清楚。本研究中，我们检测了经典Wnt信号通路下游TCF／LEF报告质粒的荧光素酶活性。过表达斑马鱼Reddl和Redd2不仅能够在体内显著拮抗Wnt3a引起的TCF／LEF荧光素酶