S-同型半胱氨酸甲基转移酶活性检测和保存方法的建立.pdf

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1、·1526·国际检验医学杂志2014年6月第35卷第12期IntJLabIVied，June2014，V0I_35，No．12·基础实验研究论著·S一同型半胱氨酸甲基转移酶活性检测和保存方法的建立刘培，周建平。，许秀丽。，郝庆钦。，温新宇，王玲，田亚平(1．解放军总医院生化科，北京100853；2．南开大学医学院，天津300071；3．军事医学科学院毒物药物研究所，北京1OO85O)摘要：目的建立一种简单的同型半胱氨酸甲基转移酶(HMT)活性测定方法，确定HMT的最佳使用条件，并初步探索HMT的保存方法。

2、方法采用原核表达系统制备HMT，经镍亲和层析和SephadexG15两步纯化。SDS-PAGE对目的蛋白进行理化性质鉴定。基于5，5一二硫基一双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)可以特异性地与含有巯基的化合物快速发生化学反应的原理，通过检测同型半胱氨酸的减少量来计算酶活性，确定HMT最佳活性测定条件。比较添加和不添加甘油的两组HMT酶液置于不同温度下保存，定期测定活力；在HMT酶液中加入不同浓度的不同保护剂，比较冷冻干燥后的活性保留率。结果重组表达的酶纯度高达95以上，相对分子质量为36000，具有良好的催化

3、活性，比活为2000U／mg。在37℃、pH7．4的HEPES缓冲液中反应25min为酶活性测定最佳条件。加入甘油能明显延长酶的保存时间并且酶液在6个月内的活力保留一半。冷冻保护剂甘露醇和海藻糖的添加对HMT酶冻干品的酶活保留率分别为104．0和100．0。结论通过基因工程技术获得HMT，建立了简单的HMT活性测定方法，并确定了该酶的最佳保存方法，为临床应用奠定了基础。关键词：同型半胱氨酸甲基转移酶；亲和层析法；活性测定；稳定性DOI：1O．3969／j．issn．1673—4130．2014．12．00

4、3文献标识码：A文章编号：1673—4130(2014)12-1526一O3ActivityassayandpreservationofS-homocysteinemethyltransferaseLiuPei，ZhouJianping，XuXiuli，HaoQingqin，WenXinyu，WangLing，TianYaping(1．DepartmentofBiochemistry，301Hospital，Beijing100853，China；2．SchoolofMedicine，NankaiUniv

5、ersity，Tianjin300071，China；3．InstituteofPharmacologyandToxicology，AcademyofMilitaryMedicalSciences，Beijing100850，China)Abstract：0bjectiveToconstructasimplemethodforthemeasurementofactivityofS-homocysteinemethyltransferase(HMT)，andexplorethebestprocessingc

6、onditionforHMTandthepreservationofHMT．MethodsHMTwasexpressedinpro—karyoticsystembyusinggeneticengineeringtechnology，thenwaspurifiedbyusingaffinityandSephadexG15chromatography．Sodiumdodecylsulphate-polyacrylamidegele1ectrophoresis(SDS-PAGE)wasperformedtoid

7、entifythephysicochemicalandbio—logicalpropertiesoftargetprotein．Basedontheprincipleof5，5一disulfide-double(2一nitrobenzoicacid)(DTNB)couldreactwithsulfydrylcompoundsrapidly，thereductionofhomocysteinewasdetecttoevaluatetheactivityofenzyme，thenthebestprocessi

8、ngconditionsofHTMweredetermined．Activityofenzyme，preservedinpreservationsolutionwithorwithoutglycerolandpreservedunderdifferenttemperatures，wasdetected．ActivityremainingratiosweredetectedandcomparedbetweenHMTpreserv