同型半胱氨酸对ecv304细胞nfκb活性的

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1、同型半胱氨酸对ECV304细胞NFκB活性的【摘要】　　目的检测同型半胱氨酸(HCY)对人脐静脉内皮细胞株ECV304的损伤对细胞核因子(NFκB)活化的影响及金雀异黄酮（GEN)的保护作用。方法以5.0mmol/L的HCY作用于ECV304细胞：设不同浓度的GEN（10、50、100μmol/L）保护组孵育12h后，再加入5.0mmol/L的HCY，通过四噻氮唑盐（MTT）比色法观察细胞活性，通过ethodsMTTassaymunohistochemistry.ResultsThecellularviabilityof5.0mmol/LH

2、CY〔(41.27±5.09)%〕entof5.0mmol/LHCYanddifferentconcentrationGEN（10,50,100μmol/L）,thecellularviabilityofeachgrouphadelevatedandtheexpressionofNFκBdecreased.ConclusionsHCYcanleadtoendothelialdysfunctioninECV304byincreasingtheactivityofNFκB.GENcanprotectthecellviabilityanddecrea

3、setheexpressionofNFκB.【Keyocysteine；ECV304cells；NFκB　　动脉粥样硬化(AS）是一类严重危害人类健康的心血管疾病，其发生发展与多种因素有关。同型半胱氨酸(HCY)属含硫氨基酸，体内不能合成，能够引起内皮细胞功能紊乱〔1〕。大量实验证明，HCY是导致AS的独立的危险因素。金雀异黄酮(GEN)，可以改善血管内皮功能〔2〕,可以抑制HCY诱导的炎症损伤,抑制内皮细胞与白细胞/血小板等黏附〔3〕,具有防止早期AS等多种药理作用及生物活性。本研究通过观察HCY对ECV304血管内皮细胞刺激的细胞核因子N

4、FκB的影响，同时观察GEN的保护作用，旨在探讨HCY致AS的机制以及GEN的保护作用，为其应用于临床治疗AS提供科学的理论依据。　　1材料与方法　　1.1主要试剂　　人脐静脉内皮细胞株ECV304（武汉大学中国生物典藏中心）；HCY、GEN、DMSO均购于Sigma公司；四甲基噻唑氮蓝(MTT)购于Fluka公司；鼠抗人NFκBp65抗体、羊抗鼠IgG、βactin抗体购于SantaCruz公司。　　1.2方法　　1.2.1ECV304细胞培养　　人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞接种于含10%灭活小牛血清的新鲜RPMI1640培养液中

5、，置37℃、5%CO2培养箱中。所有实验操作均采用对数生长期的细胞。　　1.2.2实验处理　　HCY用无血清1640培养液混匀，GEN用DMSO溶解，实验分为5组，正常对照组；HCY5.0mmol/L组；GEN10μmol/L+HCY5.0mmol/L组；GEN50μmol/L+HCY5.0mmol/L组；GEN100μmol/L+HCY5.0mmol/L组。对照组加不含任何药物的培养液100μl，每组设4个复孔。　　1.2.3MTT法检测细胞生长情况　　参照Tada测定细胞活性的改良法〔4〕，消化细胞调整浓度至4×104ml-1，接种于96孔培养板

6、，每孔100μl，培养过夜，细胞贴壁生长，80％融合时，吸弃原培养液。实验组预先加入终浓度为0、10、50、100μmol/L的GEN孵育12h，再分别加入终浓度为5.0mmol/LHCY的RPMI1640培养液100μl，对照组加不含任何药物的培养液100μl，每组设4个复孔；同时设空白对照（只有培养液，无细胞）。继续培养48h。上述每孔分别加入20μlMTT(5mg/ml)，置5%CO237℃孵育4h后，加三联溶解液每孔100μl(10%SDS+5%异丁醇+0.012mol/L的HCl)，二氧化碳培养箱中继续培养14h，镜下观察甲臜结晶全部溶解后

7、，以空白孔调零，酶标仪检测570nm处的吸光度值(A570)。细胞活力(%)=实验孔A570值/对照孔A570值×100%。　　1.2.4SDSPAGE电泳及l，4℃离心，500r/min，3min收集细胞，提取的胞浆蛋白和核蛋白用考马斯亮兰法（Braford法）进行蛋白定量。12％聚丙烯酰胺凝胶电泳（V=70V/40min、120V/2h），转膜（I=180mA）4h至PVDF膜上，5％脱脂奶粉封闭，鼠抗NFκBp6537℃孵育1h，PBST洗4次，辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG室温下摇荡孵育1h，PBST洗4次，ECL液显色，自动凝胶成像

8、系统处理，测量条带光密度值（OD值），以βactin为内参照，求得比值，进行半定量分析，试验重复3次。