禽传染性支气管炎病毒M基因自杀性DNA疫苗及免疫效应研究.doc

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1、禽传染性支气管炎病毒M基因自杀性DNA疫苗及免疫效应研究预防兽医学：向菁指导老师：王红宁教授黄勇副教授自杀性DNA疫苗是指将引起免疫应答的目的基因片段插入以甲病毒为基础的质粒载体构建而成的一种新型DNA疫苗，它可引起宿主细胞调亡，并且通过抗原的高效表达刺激机体产生免疫应答，是更为安全有效的基因工程疫苗。鸡传染性支气管炎病毒重要免疫原基因之一的M基因上存在重要的抗原决定簇，且具有高度保守性。M基因与病毒的复制有关，大小约700bp。已有的IBV疫苗文献报道中关于M基因免疫效应的研究较少。本研究通过PC

2、R扩增在两端引入BamHⅠ酶切位点，经酶切插入自杀性DNA疫苗载体pSCA1，构建了自杀性DNA疫苗pSCA1-M质粒，经由菌落PCR、酶切及测序鉴定目的基因被成功克隆至自杀性DNA疫苗载体pSCA1，且方向正确。以1：20的配比加入脂质体作佐剂，制备了IBVM基因的自杀性DNA疫苗。分别取等量的重组质粒pSCA1-M、常规IBVM基因DNA疫苗质粒pcDNAM、空载体pSCA1转染Vero细胞。48h后经间接免疫荧光试验观察发现，pSCA1-M以及pcDNAM转染组细胞浆均可见特异性亮绿色荧光，p

3、SCA1空载体组无荧光为阴性。证实自杀性DNA疫苗载体能成功表达M基因。为评价IBV自杀性DNA疫苗的免疫效应，分别用构建的自杀性DNA疫苗pSCA1-M、常规DNA疫苗pcDNAM、空载体pSCA1和IBV灭活疫苗免疫非免疫原健康雏鸡，对照组注射PBS液。自免疫后每周采血分离血清连续五周，采用间接ELISA试验检测血清特异性抗体IgG，结果表明：自杀性DNA疫苗产生针对IBV的特异性血清抗体，免疫后第三周上升到峰值，随后开始下降，其抗体水平与常规IBVDNA疫苗相当，低于灭活疫苗。用流式细胞仪(F

4、ACS)测定各组CD3+、CD4+、CD8+动态变化，结果显示：自杀性DNA疫苗pSCA1-M组CD3+、CD4+、CD8+各T淋巴细胞数量平均水平均高于其余各组，在各个时间点均表现为差异显著（P﹤0.01或P﹤0.05）。但在第4周左右有一个明显的下降，之后又回升。说明自杀性DNA疫苗能诱导机体产生高水平的细胞免疫。攻毒保护试验结果表明：pSCA1-M组共5只鸡发病死亡，攻毒保护率为75%；pcDNAM组免疫鸡只保护率低于pSCA1-M，为65%；空载体组和PBS组共10只鸡发病死亡；灭活苗组无鸡

5、只发病。本研究采用IBVM基因构建自杀性DNA疫苗对鸡进行免疫，并对其免疫效果进行评价，在国内外还未见报道。可为研制IBV自杀性DNA疫苗提供了基础材料和科学依据。关键词：禽传染性支气管炎；M基因；自杀性DNA疫苗；细胞免疫；体液免疫