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1、第24卷第4期质谱学报Vol.24No.42003年10月JournalofChineseMassSpectrometrySocietyOct.2003生物质谱作为SNP分型检测方法的研究1,2131,211,3杨何义,蔡 耘,王 杰,周钢桥,贺福初,钱小红(1.军事医学科学院放射医学研究所基因和蛋白组,北京 100850;2.国家人类基因组北方研究中心,北京 100176;3.军事医学科学院国家生物医学分析中心,北京 100850)摘要:利用改良的Miller法从人血中提取人类基因组DNA。采用聚合酶链式
2、反应(Polymerasechainreac2tion,PCR),对含有单核苷酸多态性(SNP)点的DNA片段进行扩增,然后用CIP和EoxI去除掉PCR体系中剩余的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)和引物,最后用单碱基延伸反应获得SNP位点处碱基类型。用基质辅助激光解吸电离2飞行时间质谱(MALDI2TOFMS)或电喷雾电离2四极杆飞行时间质谱(ESI2QqTOFMS)检测延伸产物与未延伸引物间的分子量差异,确定该点处碱基。对不同的生物质谱检方法以及生物质谱检测方法与其它检测方法的优缺点进行了分析比较。关键词
3、:质谱学;单核苷酸多态性(SNP)分型;基质辅助激光解吸电离2飞行时间质谱(MALDI2TOFMS);电喷雾电离2四极杆飞行时间质谱(ESI2QqTOFMS)中图分类号:O657.63;Q524.3文献标识码:A文章编号:100422997(2003)042449207 截止到现在,人们已经知道包括人类在内的方面:首先在基因组序列上找到单核苷酸多态性几十种生物体基因组DNA序列,接下来的工作位点,即SNP作图(SNPmapping);其次,在大重点将转移到对基因组DNA序列进行多态性量的样本中测定每一个S
4、NP的等位频率,即研究,最终弄清生物体生物学性状差异的遗传基SNP分型(SNPgenotyping);最后对所得的数础。单核苷酸多态性(Singlenucleotidepolymor2据进行连锁不平衡分析或关联分析,以找出其中phism,SNP)是指在基因组DNA某个位置处存所隐含的生物信息。随着大量的单核苷酸多态位在有单个碱基的差异,其在人群中发生频率超过点的发现,人们感兴趣的是想知道不同人群的感1%,人类基因组DNA序列90%多态性是由兴趣SNP位点处等位基因频率(包括疾病人群[1]SNP造成的。由于S
5、NP具有高密度、高稳定性和正常人群、不同种族人群等等),这往往需要对等特点,使得它成为继限制性片段多态性和微卫成千上万个样本进行分析,工作量非常巨大,因星多态性之后的新一代遗传标记物,在解释多基此急需一些高通量、低成本的SNP分型技术,以因病遗传途径、药物基因组学、法医学和进化遗满足这一需求。传学等方面有着非常重要的作用。SNP的研究生物质谱的发展基于20世纪80年代产生已成为当前功能基因组研究中的一个新的热点的一些新的软电离方式,包括电喷雾电离质谱领域。对单核苷酸多态性研究一般包括以下几个(Electro
6、sprayIonization2MassSpectrometry,收稿日期:2003202217;修回日期:2003209209基金项目:“十五“863计划资助项目(2001AA224011)作者简介:杨何义(1974～),男(汉族),山西闻喜人,在读博士研究生,药物分析专业E-mail:yanghy@hotmail.com3通讯作者:钱小红,教授,电话:010266932025,E2mail:qianhh@nic.bmi.ac.cn450质谱学报 第24卷 ESI2MS)和
7、基质辅助激光解吸电离质谱(Ma2括上游引物和下游引物),0.05单位(U)HotStartrix2AssistedLaserDesorptionIonization2MassTaqDNA聚合酶,3.0mmolMgCl2,300Lmol脱Spectrometry,MALDI2MS)等,使得生物质谱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs),1х反应buffer。反能用于分析高极性、难挥发和热不稳定性生物大应条件为:95℃15min(活化DNA聚合酶),94[2]分子。由于生物质谱具有快速、准确、灵敏、高℃变性30s,55
8、.5℃退火30s,72℃延伸30s,通量等特点,在功能基因组领域得到充分的应进行35个循环。PCR产物用2.0%琼脂糖凝胶用。目前国外已有诸多文献报道生物质谱在电泳检测。SNP分型方面的应用,主要是采用MALDI21.3.2 去除未反应的引物和脱氧核糖核苷三磷TOFMS。本工作中拟建立用MALDI2TOFMS酸(dNTPs) 于PCR反应体系中加入1.5单位进行SNP分型,希望尝试ESI2QqTOFMS在(U)小
