snp 检测方法之比较

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1、SNP检测方法之比较 一、定义   单核苷酸多态性(singlenucleotideolymorphisms,SNPs) 主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。 二、SNPs的研究意义遗传标记   具有已知性、可遗传性、可检测性，用于疾病基因的定位、克隆和鉴定。 基因多态与疾病相关性   研究SNPs本身对机体的影响，尤其是疾病的易感性、个性化医疗。 三、SNPs检测方法的分类1.测序方法      常规测序，Pyrosequencing（焦磷酸测序），微测序(SNaPshot)2.基于杂交的

2、方法    Taqman探针法，Microarray芯片法，3.引物延伸    MALDI-Tof，dHPLC（变性高效液相色谱技术）4.以构象为基础的方法    RFLP，SSCP，DGGE5.溶解曲线    HRM(高分辨率溶解曲线分析技术) 四、各方法概述与比较测序方法1.测序方法------一般测序和焦磷酸测序步骤：    序列比对——引物设计——DNA提取——PCR——割胶纯化——直接测序或装克隆测序。优点：   SNP分析金标准，能发现已知SNP，也能发现未知SNP。缺点：   每个样本的每个位点均需要经PC

3、R扩增，跑胶，然后切胶纯化，再测序。步骤多而分散，成本较高，工作量大，周期长，价格昂贵，不适合大样本多位点检测。2.测序方法------微测序方法（SNaPshot）微测序流程：   1.设计PCR扩增含SNPs位点的一段DNA   2.对PCR产物进行纯化（去除引物和dNTP)   3.引物延伸   4.延伸产物检测（放射性同位素标记法、发光检测法、凝胶      为基础的荧光检测法、质谱分析法、变性高压液相色谱法等）优势：   类似普通测序，但10个位点PCR产物同时引物延伸，通量增加。劣势：前处理等同普通测序：每个

4、样品的每个位通过点都需要PCR预先扩增，跑胶，割胶，DNA纯化。不同是10个位点可以同时测序，提高了测序效率，但对延伸引物要求极高，如每个引物有4-6个碱基差异，不能有互补区段，还要相同条件延伸，除厂家已经验证的少数位点外，很难自己设计针对新位点的检测。多个分散步骤，费钱费时，易出错。 3.测序方法------费用成本组成：     ?基因组DNA提取费用     ?引物设计及合成费用    ?PCR扩增费用     ?PCR产物纯化费用     ?测序费用   基于杂交的方法1.杂交方法----Taqman探针技术步骤

5、：   序列比对——引物和特异探针设计——DNA提取——PCR——结果分析。优点：   准确度高，适合样本多、位点数量少的检测。缺点：价格昂贵（探针合成费用高），仅检测已知SNP位点，不能同时发现未知SNP。Taqman费用成本组成?DNA提取费用?引物合成费用?荧光探针合成费（昂贵）?PCR扩增费用 2.杂交方法---Microarray芯片法优点：   高通量，适用于全基因组SNP扫描，适用于少样本、多（全）SNP位点筛查；缺点:  准确度偏低，需要第二种方法验证；  只能识别已知SNP位点；  不适宜多样本、少数S

6、NP位点的检测；  价格昂贵。    引物延伸1.引物延伸-----MALDI-Tof质谱分析操作流程:①人类基因组DNA的制备；②PCR；③PCR产物的纯化；④等位基因特异性引物延伸反应；⑤等位基因特异性引物延伸反应产物的纯化；⑥样品的制备；⑦检测及基因分析。优点：   快捷、所需样标本量极少。缺点：   前处理工艺复杂，包括一次PCR、一次特异引物延伸、两次纯化。要求高，必须去除样品中的干扰性离子（钠，钾），方能获得真实信息的MALDI-TOF波谱。 适宜于已经优化的特定SNP检测，不适宜该服务商未做过的新SNP检测

7、。MALDI-Tof费用及网上报价评价      成本明细                                                DNA提取费用 引物合成费用 PCR费用 DNA纯化 特异性延伸引物 DNA再次纯化 MALDI-Tof检测         2.引物延伸---dHPLC流程：   DNA提取- PCR扩增-变性后缓慢复性-检测以及分析优点：   快速、低成本、高灵敏缺点：可判断有否突变，不能确定SNP的位置和类型，需用标准样品或结合测序验证。只能检测杂合突变是DHPLC的主要不足之处

8、。在SNP筛查的检测通量、灵敏度与成本等方面与最新的HRM技术相比都明显落后。dHPLC检测的成本构成：?DNA提取费用?引物合成费用?PCR扩增费用?dHPLC检测费用   溶解曲线 1.溶解曲线----HRM技术步骤：   序列比对---引物设计---DNA提取---荧光染料（EvaGreen或LCgreen）P