snp 检测方法

《snp 检测方法》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、单核苷酸多态性（SNP）林壹明2011/5/9主要内容一、SNP概念、分类与特点二、SNP检测技术三、SNP研究现状四、SNP应用前景SNP(singlenucleotidepolymophism)即单核苷酸多态性，是指群体中变异频率大于1%的单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态性，包括转换、颠换、缺失和插入。但是比较常见的是转换和颠换，大约占80%。一般来说，一个SNP位点只有两种等位基因，因此又叫双等位基因。SNP在人基因组中的发生频率比较高，大约平均每1000个碱基中就有一个多态位点。SNP概念SNP分类根据在基因中的位置，SNP可分为基因编码区SNP(co

2、dingSNP,cSNP)、基因内含子区SNP和基因调控区SNP(regulatorySNP,rSNP)。其中cSNP根据是否改变编码的氨基酸又可分为同义cSNP(synonymouscSNP)和非同义cSNP(non-synonymouscSNP)。SNP的主要特征（一）、密度高。SNPs在人类基因组中的总数超过300万。（二）、遗传稳定性好。（三）、分布不均匀。非编码区的数目远远大于编码区的数目。（四）、具有代表性。（五）、分析易自动化。由于每个SNP位点通常仅含两个等位基因——双等位基因(biallele)，在检测时能通过一个简单的“+/−”分析进行基因型

3、分型，而无需分析片段的长度，因而易于自动化。SNP检测技术理想的检测SNPs的方法——发现未知的SNPs，或检测已知的SNPs必须具备以下优点:(1)适合自动化操作,简便、迅速;(2)分析费用低,特殊试剂用量少;(3)反应要严紧,即使不纯的样品也可得到可靠的结果;(4)数据分析简单,易于自动化分析;(5)反应的通量要大而灵活,一天可以完成几百，甚至到上百万个样品的检测与分析。现在常用的SNP检测技术：1.基于杂交的方法2.基于酶的方法3.电泳法4.直接测序法另外还包括化学法（如高锰酸钾法），物理法（例如基质辅助的激光吸附／离子化飞行时间质谱分析）等。1.基于杂交

4、的方法原理:短的核苷酸探针在和互补的目的片段进行杂交时，在完全匹配和有错配两种情况下，根据杂交复合体稳定性的不同而将SNPs位点检测出来。（Tm差异越大，检测的特异性就越好）分为：(1）利用△Tm；(2）杂交+荧光探针。(1)利用△Tm固定温度等位基因特异核苷酸探针(Allele-specificoligonucleotide，ASO)。修饰过的探针：引入一个错配的碱基、PNA、LNAs等动态的加热过程动态等位基因特异杂交(dynamicallele-specifichybridization,DASH)核酸肽探针（Peptidenucleicacids，PN

5、A)其骨架是肽键特点：1、与靶分子高特异性地结合（3个方面的影响）；2、链挤入（形成三链复合结构）（表达调控以及反义治疗方面）；3、对核酸酶和蛋白酶均不敏感（体外应用）。与靶分子高特异性地结合Tm值高受盐浓度影响小（低盐浓度的体系）△Tm更大（一个PNA碱基的错配会使其Tm值降低8-20度）所以，PNA/DNA的非特异结合能得到很好的排除。LNA(lockednucleicacids)其结构是在RNA分子的2′羟基和核糖环的4′碳原子间连入一个亚甲基的“桥”。特点：1.能以很高的亲和性和互补的DNA、RNA或LNA结合（构象更利于杂交的稳定）2.匹配和不匹配之间

6、的△Tm增加DASH(dynamicallele-specifichybridization）（2）杂交+荧光探针分子信标（双分子间杂交）分子信标（Molecularbeacons）是在样品PCR过程中因和样品DNA杂交后而使自身荧光构象改变从而实现SNP的检测。分子信标是一种新型的发夹结构的寡核苷酸探针2.基于酶的方法1）DNA聚合酶2）连接酶3）限制性内切酶4）外切酶FEN5）RNaseHDNA聚合酶法Taqman法单碱基延伸法焦磷酸测序法此类方法是根据PCR过程中要求引物和模板间的严格互补配对来实现对SNP位点的检测,是基于以下两点:(1)错配出现在引物中

7、部时致使稳定性降低,在严格杂交条件下将不能退火;(2)错配出现在引物3′端时,引物将不能延伸。因此针对不同等位基因设计平行引物,上游引物的3′端和多态性位点互补,这样只有和引物完全互补的序列才能得到扩增,不同的等位基因依赖于所使用的不同引物分别得以扩增。产生的PCR产物可以通过凝胶电泳或实时的荧光测定来实现对其的分析。Taqman法优点：闭管进行，减少污染。缺点：淬灭难以彻底，本底较高。单碱基延伸法（singlebaseextension)基本步骤1.设计PCR扩增含SNPs位点的一段DNA。2.对PCR产物进行纯化（去除引物和dNTP)。3.引物延伸。4.延伸

8、产物检测（放射性同位素标